CRISPR基因編輯結果全靠猜？No，部分可預測

　　CRISPR-Cas9系統已成功用于多個生物的基因組編輯，然而，我們還不能很好地預測特定位點上的編輯結果。為此，英國弗朗西斯?克里克研究所的研究人員對近1,500個目標位點上的編輯結果進行系統分析，發現各個位點之間的編輯精確性差異很大。

　　研究人員發現，編輯精確性與編輯效率相關，并且可根據某些簡單的規則來預測編輯結果，如PAM序列上游的第四個核苷酸。他們還發現，插入缺失的圖譜受染色質特征的影響。這項結果近日發表在《Molecular Cell》上。

　　“到目前為止，CRISPR對基因的編輯還伴隨著不少猜測和試錯，”資深作者Paola Scaffidi說。“人們一度認為，CRISPR的結果是隨機的、無法預測的，不過在分析了數百個編輯之后，我們驚訝地發現這背后其實有著可預測的簡單模式。這將徹底改變我們使用CRISPR的方式，讓我們更精確地研究基因功能。”

　　為了鑒定Cas9核酸酶誘導的插入缺失的一般模式，研究人員選擇了450個核基因上的1,491個位點，并利用多個sgRNA來介導編輯。對于每個基因，他們至少選擇了三個位點。總共有1,248個位點出現了可檢測的插入缺失。

　　研究人員又觀察了一些常見的編輯模式。對大多數的目標而言，單核苷酸插入缺失是最常見的插入缺失形式，其中44%的位點表現出單核苷酸插入，而26%的位點表現出單核苷酸缺失。不過，某些位點也傾向于更長的缺失，如長達41個核苷酸。

　　同時，他們還發現CRISPR誘導的插入缺失往往會導致移碼突變。平均而言，80.1%的插入缺失破壞了基因編碼框。不過，有三個位點更傾向于產生符合讀框（in-frame）的插入缺失，這表明針對它們的基因敲除可能難以成功。

　　接下來，研究人員根據插入缺失的模式開展分層聚類分析，將這些目標位點分成四組，包括傾向于小的插入、小的缺失、長的缺失的位點，以及無明顯傾向的位點。他們還發現sgRNA的活性是高度可變的，而插入缺失的數量與混合物中的sgRNA豐度不相關。

　　“不同的目標位點表現出不同的傾向，這促使我們去研究各個位點的編輯精確程度，”作者在文中寫道。“這一分析表明編輯精確性差異很大，某些位點顯示出79個不同的插入缺失，而某些位點只有一個主要的插入缺失。總體而言，對于約五分之一的目標位點，人們至少有50%的機會誘導出特定的插入缺失，而大多數位點更難以預測。”

　　后續的分析表明編輯精確性與編輯效率、插入缺失類型和插入缺失大小相關。他們還觀察到某些DNA序列對編輯精確性有明顯的影響。具體來說，PAM序列上游的第四個核苷酸對編輯精確性具有最強的影響。PAM上游的第二個、第三個和第五個核苷酸也有作用，不過比第四個核苷酸要弱。

　　研究人員總結道，編輯精確性是位點特異性的，并且可以預測的，這具有重要的意義。“實際上，了解特定位點可能發生哪些編輯結果，能夠最大限度獲得理想的序列改變，適用于臨床和科研應用，”他們談道。