新方法！血清鈉離子候選參考方法的建立及性能評估

　　題目：基于火焰原子發射光譜法血清鈉離子候選參考方法的建立及性能評估

　　作者：劉春龍，胡月，任軼昆，孫茜

　　單位：北京利德曼生化股份有限公司

　　通訊地址：北京市亦莊經濟技術開發區興海路5號

　　郵編：100176

　　聯系電話：18211149376

　　Email:chunlong.liu@leadmanbio.com

基于火焰原子發射光譜法血清鈉離子

候選參考方法的建立及性能評估

劉春龍，胡月，任軼昆，孫茜（北京利德曼生化股份有限公司參考實驗室，北京100176）

摘要 目的 建立基于火焰原子發射光譜法的血清鈉離子候選參考方法并評估其性能。方法 使用鈉離子國家標準物質配制標準曲線校準血清鈉離子候選參考方法，用國際標準物質909C評估方法的正確度，用利德曼公司兩濃度工作校準品評估方法的精密度，通過參加2016年國際參考實驗室外部質量評估計劃（Rela）進一步驗證方法的性能。結果 鈉離子標準曲線線性方程為Y=0.0012407X+0.0066857，r²=0.9992；正確度評估結果為偏移-0.53%；利德曼公司高低兩濃度工作校準品的總不精密度分別為0.57%和1.23% ，兩者均<1.5%； Rela結果在等效限范圍內。結論 基于火焰原子發射光譜法的血清鈉離子候選參考方法建立成功，可極大地推進血清鈉離子的標準化進程，為血清鈉離子試劑盒的量值溯源提供了保障。

關鍵詞：血清鈉離子；火焰原子發射光譜法；候選參考方法；性能評估

　　鈉離子是細胞外液(如血液)中最多的陽離子，對保持細胞外液容量、調節酸堿平衡、維持正常滲透壓和細胞生理功能有重要意義，并參與維持神經-肌肉的正常應激性。細胞外液鈉濃度的改變可由水、鈉任一含量的變化而引起，所以鈉平衡紊亂常伴有水平衡紊亂。水與鈉的正常代謝及平衡是維持人體內環境穩定的重要因素。因此，血清鈉測定具有重要的臨床意義，尤其有助于電解質紊亂的治療。然而，由于臨床常規檢驗血清鈉離子的方法學較多，且不同方法學之間存在一定的差異，導致其測量結果的標準化工作困難重重。建立穩定有效的參考方法對于促進鈉離子檢驗標準化具有重要價值是行業內共識。本研究基于火焰原子發射光譜法，嘗試建立一種穩定性好，準確度高（正確度和精密度良好）的血清鈉離子候選參考方法，為體外診斷廠家鈉離子常規測量系統向參考系統溯源提供新的途徑。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 原料 氯化鈉GBW(E)060024C國家標準物質（純度99.97%）、 濃硝酸（濃度15.4mol/L）、氯化鉀（鈉含量≤0.02%），均購自Sigma公司；超純水（電阻率在達到10⁴Ω）。

　　1.1.2 儀器 島津AA-7000原子吸收分光光度計、哈密爾頓Microlab-500型稀釋配液儀、賽多利斯CP225D型電子天平、Eppendorf移液器。

　　1.2 試劑配制

　　1.2.1 總原則 所有與試劑、水或樣本接觸的玻璃或者塑料器皿均按下面的序列清洗：將玻璃器皿在放在0.77mol/L HNO3中浸泡60min→用去離子水沖洗（至少6次）→在無塵環境中倒置自然干燥。

　　1.2.2 配制步驟

　　1.2.2.1氯化鉀稀釋液（KCl4.5mmol/L）：稱取0.336gKCl，在轉移到1000mL容量瓶中，用水定容，顛倒20次混勻。氯化鉀溶液作為鈉標準貯備液的稀釋液和空白貯備液使用。

　　1.2.2.2鈉標準貯備液：準確稱取0.6428、0.7013、0.7597、0.8182、0.8766和0.9350g干燥的NaCl（GBW(E)060024C）（準確至0.1mg），分別轉移至100mL容量瓶中，用KCl稀釋液（4.5 mmol/L）定容，顛倒20次混勻。

　　1.2.2.3全部溶液都放至室溫，用稀釋配液儀按1:100用水稀釋鈉標準貯備液和樣本。

　　1.3 測量步驟 調零后測量從160mmol/L的標準貯備液稀釋的標準液發射光相對強度，發射光相對強度值的重復性在±0.5%以內，儀器達到穩定狀態。分別測量空白和標準液，并記錄它們的發射光相對強度值E（儀器自動扣除空白）。用扣除空白后的發射光的相對強度值做標準曲線，r²＞0.9990，否則找出偏差較大的點重新測量，如果偏差還比較大，重新配制標準液。用國際標準物質909C評估方法的正確度，重復測量3次。用利德曼公司兩濃度工作校準品評估方法的精密度，每天重復測量5次，連續3天。

　　1.4 統計學處理 以濃度值為X軸，扣除空白后的發射光的相對強度值為Y軸，使用EXCEL2007軟件繪制線性回歸圖，即標準曲線。計算國際標準物質909C實測值與靶值的相對偏移，合格標準為<1.0%；計算利德曼公司兩濃度工作校準品實測值的總不精密度，合格標準為<1.5%。

　　2 結果

　　2.1 方法的線性 對該候選參考方法進行優化后，標準曲線實驗結果見圖1，其線性方程為Y=0.0012407X+0.0066857，r²=0.9992>0.9990。

圖1 鈉離子標準曲線

　　2.2方法的正確度 國際標準物質909C靶值為141.84mmol/L，實測值與靶值偏移均<1.0%，正確度驗證通過，實測數據見表1。

表1 鈉離子正確度（單位：mmol/L）

　　2.3 方法的精密度 利德曼公司高低兩濃度工作校準品的總不精密度分別為0.57%和1.23% ，兩者均<1.5%，精密度驗證通過，實測數據見圖2。

圖2 鈉離子精密度散點圖

　　2.4 國際參考實驗室外部質量評估計劃（Rela） Rela結果在等效限范圍內，進一步可證明所建方法的正確度和可靠性。回報結果見圖3，箭頭所標示點為本實驗室結果。

圖3 國際參考實驗室外部質量評估計劃（Rela）鈉離子回報結果

　　3 討論

　　國際檢驗醫學溯源聯合委員會（JCTLM）一直致力于檢驗醫學的標準化研究，其中血清鈉離子由于實驗室常規方法有離子選擇性電極法、原子吸收分光光度法、火焰光度法、比色法和酶法等，不同的方法學之間存在一定的差異。血清鈉離子又是臨床醫生判斷電解質紊亂情況的重要指標，量值溯源被認為是實現臨床檢驗標準化唯一而有效的途徑， 而參考系統（包括參考物質、參考測量程序、參考實驗室），尤其是參考測量程序在實現量值溯源過程中起到承上啟下的作用^[1]。因此各體外診斷廠家有必要按臨床化學和檢驗醫學聯合會（IFCC）的標準，建立血清鈉離子的參考方法。

　　火焰原子吸收光譜法被廣泛應用于金屬元素的測定，測定簡便，結果可靠^[2]。本研究建立的鈉離子候選參考方法基于火焰原子發射光譜法，將血清用水準確稀釋，進行分析與測定。發射光譜法是測定被測定離子的發射光相對強度。樣品中的鈉原子接受火焰的熱能而被激發處于激發態。激發的原子不穩定，立即發射出特定波長的光線，迅速回到基態。發射光線的強度與樣品中的鈉離子的濃度呈正比關系^[3]。該方法性能良好，尤其是正確度和不精密度，但運行成本較高，通量較小，不適用于臨床實驗室的常規測量，建議在規范的醫學參考實驗室運行。

　　參考方法的建立務必建立在對各個細節的嚴格確認。本研究中儀器設備的狀態非常重要，如島津AA-7000使用前主機需預熱60min以上，空心陰極燈需預熱30min以上。確認火焰狀態，調整分壓閥空氣壓力為0.35～0.38MPa，乙炔氣瓶需調整壓力為0.09～0.10MPa。檢查燃燒器，確認預混合室和霧化器中潔凈無異物。吸入超純水后預熱機器10min。文中所述制備溶液的物質均指100％含量，若不足，應按照純度進行換算。選用稀釋配液儀對鈉標準貯備液和樣本進行稀釋，可明顯提高測量的重復性水平。對于鈉濃度較高的樣品，會因稀釋倍數過大，降低測定的精密度，因此常選用次靈敏線測定^[4]。

　　本文所建立的候選參考方法，仍需進一步研究和完善，補充該方法的抗干擾、穩健性等。該法的建立可促進血清鈉離子的標準化進程，為體外診斷廠家常規試劑盒的量值溯源提供了新的途徑。

　　4 參考文獻

　　[1]郭瑋，陳方俊，潘柏申．膽固醇檢測方法的發展歷史及標準化[J]．檢驗醫學，2013，28（11）：970-974.

　　[2]柴龍龍，王鳳山，王彥厚，等.火焰原子吸收分光光度法測定血液保存液Ⅲ中鈉含量[J].中國藥業，2016，25（19）：59-60.

　　[3] Rance A. Velapoldi, Robert C. Paule, Robert Schaffer et al. A Reference Method for the Determination of Sodium in Serum[J], NBS Special Publication,1978, 260-60.

　　[4]水質鉀和鈉的測定火焰原子吸收分光光度法，中華人民共和國國家標準，GB11904-89 [S].

　　本文來源于2018年蛋白和肽類藥物及診斷試劑研發與質控國際研討會（PPTD 2018）精選投稿論文，更多詳情歡迎了解PPTD會議簡介。

　　PPTD會議簡介：

　　蛋白和肽類藥物及診斷試劑的有效性評價和質量的精確控制是目前全球生物產業面臨的巨大挑戰之一，是企業研發的重點，是標準化工程化開發的前提。為推動體外診斷與肽類、蛋白質藥物工程化發展，加強計量及分析表征技術對該領域質量控制及標準化的支撐，更好地促進我國體外診斷與肽類、蛋白質藥物研發生產等相關技術交流，中國計量科學研究院、國際計量局（BIPM）、成都市人民政府、中國食品藥品檢定研究院聯合主辦了2016年“蛋白和肽類藥物及診斷試劑研發與質控國際研討會（PPTD 2016）”。國際計量局、國際檢驗醫學溯源聯合委員會（JCTLM）、世界衛生組織（WHO）、國際臨床化學聯合會（IFCC）等國際組織，及多國計量院和世界著名生物醫藥企業的30余名代表和中國科學院、中國工程院、相關科研院所、高校和企業的約450名國內代表參加了會議。與會代表以計量技術為橋梁，對前沿研究、藥物研發、臨床醫學檢驗技術及標準化等研究熱點展開了交流。本次研討會促進了生命科學計量新領域的發展，加強了世界各國、各組織在化學生物計量領域的交流與合作，建立了蛋白和肽類藥物前沿研究與工程化轉化的橋梁與紐帶；同時為研發、質控、科技創新以及產業化等全鏈條合作奠定了基礎，在國際上獲得了廣泛贊譽。

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