哈佛“大神”最新Cell：“魔剪”CRISPR為何越來越“牛”？

　　David R. Liu現為哈佛大學化學與化學生物學教授、Howard Hughes醫學研究所研究員、Broad研究所Associate Member。他與張鋒、George Church等人是納斯達克CRISPR“第一股”Editas公司的聯合創始人。

　　筆者曾在《揭秘被IPO刷屏的Editas！除了張鋒，背后“頂級學術大牛”還有他們……》一文中介紹過David R. Liu近幾年發表的基因編輯論文。今年4月20日，他以通訊作者的身份在Nature雜志上（論文題目：Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems）發表了基因編輯領域一項重要成果，實現了CRISPR只“剪”單個堿基的突破。

　　Liu表示，這些點突變非常重要。事實證明，大多數與遺傳變異相關的疾病都是點突變。現有的遺傳方法對修復點突變都不是非常有效。今年8月和10月，Science和Nature Methods上相繼發表了2篇類似的研究成果，為CRISPR只剪單個堿基的功能提供了更多的證據。

　　“大神”Cell新綜述

　　今天再提這位“大神”是因為他11月17日在Cell雜志上發表了一篇新的CRISPR綜述（題目：CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes），匯總了能夠實現哺乳動物基因組編輯的、基于CRISPR的技術，以及這些技術的多種應用，強調了基因編輯技術在基礎研究、生物技術、疾病治療等方面的一些顯著進展。

　　能夠向基因組DNA序列中引入理想變化的基因編輯技術引發了生物醫學的革命，為治療許多人類疾病帶來了可能。理想的基因編輯工具是能夠以非常高的效率以及DNA序列特異性編輯任何基因位點，且帶來很少（或者沒有）不希望產生的副“產品”。目前，這樣一個理想的工具還未被開發出來，也不太可能存在于自然界中。因為，自然存在的基因編輯蛋白經過進化后只獲得了部分相關的功能，如調節基因表達或預防病毒感染。因此，研究人員認識到，他們需要開發新的工具，增加基因編輯的范圍和有效性，改善在真核細胞和人類疾病動物模型中的應用。近期，科學家們已經在實現這一目標的道路上取得了顯著的進步。

　　基因編輯發展歷程

　　最早期的基因編輯研究與內源性細胞同源重組修復途徑有關。這一途徑能夠被用于替換活細胞中一小部分基因組。要想使用這一基因編輯策略，外源DNA序列必須與目標DNA位點具有同源性。不過，這一初級版的基因編輯技術效率非常低，且會誘發不良的基因編輯事件。相比整合到預期位點，外源DNA序列更頻繁地插入到了基因組的隨機位置。

Figure 1. Genome Editing UsingDoubleStranded Breaks

圖片來源：Cell

　　1989年和1994年相繼發表的兩項研究在克服這一技術的限制性方面取得了關鍵的進展。研究發現，使用meganuclease（一種能夠識別和切割長DNA序列的核酸內切酶）引入雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB）到基因組位點中能夠刺激同源驅動的DNA整合（圖1A）。這種‘‘homology-directed repair’’（HDR）策略增加了基因編輯的有效性。

　　然而，盡管在這方面有了突破，但彼時的基因組編輯依然有2個主要的缺點。第一，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）也會發生在DSBs位置，且通常比HDR更有效，這會導致在目標位置發生隨機插入和刪除（圖1A）。克服這一障礙是當前研究的熱點，在這一綜述中，作者們也進行了討論。

　　第二，meganuclease切割特定目標位置的幾率很小。為了解決這一問題，研究人員轉向了鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription-activator-like effector nucleases ，TALENs）。研究表明，經設計的ZFNs 和TALENs在編輯目標基因組位點中表現出了極高的特異性（圖1B）。它們與近幾年出現的CRISPR-Cas9技術組成了基因編輯工具的三大家族。

　　7大主要內容

　　CRISPR-Cas9的亮相對生命科學領域產生了革命性的影響，使得科學家們能夠快速發現新基因的功能，開發新的細胞和動物模型，并在開發人類疾病療法中取得了實質性的進展。綜述正文主要包括7個部分的內容，以下是各部分內容簡介：

　　第1部分內容中，作者們列舉了用于多種哺乳動物基因組編輯的、天然的CRISPR核酸酶（表1）。

　　第2-4部分內容中，作者們列舉了擴大Cas9靶向范圍、提高DNA特異性（圖2）以及產物選擇性（圖3）相關的研究進展。

Figure 2. Strategies for Improving the DNA Specificity of CRISPR-Based Agents

圖片來源：Cell

Figure 3. Approaches that Improve the Product Selectivity of Genome-Editing Agents

圖片來源：Cell

　　第5部分內容中，作者們指出，為了改變給定基因組的DNA序列，研究人員也已開始編輯表觀基因組（圖4）。

Figure 4. CRISPR-Based Epigenome Editing

圖片來源：Cell

　　第6部分內容中，作者們討論了基因編輯系統的導入問題。文章稱，這依然是基因編輯很多應用的重大阻礙（圖5）。

Figure 5. Strategies for In Vivo Delivery of CRISPR-Based Genome-Editing Agents

圖片來源：Cell

　　第7部分內容中，作者們總結了基于CRISPR的基因編輯技術的多種應用，包括疾病治療研究、高通量基因篩查、Gene Drives等。

　　結論

　　CIRSPR的發現和表征改變了基因編輯和生命科學，而不斷升級的新型CRISPR技術的發展加速了這一轉變。它們的出現使得研究人員擁有了研究活體系統以及人類疾病強有力的工具。值得注意的是，隨著這些技術應該范圍以及能力的增長，道德和監管指南也必須隨之建立。這樣才能確保合理利用這類技術為人類帶來益處與濫用帶來風險之間的平衡。