cDNA的篩選3

免疫學染色
1.為了洗去頂層瓊脂上的殘余物和細胞碎片，將硝酸纖維素濾膜一次最多5張轉移放在搖床上的盤子（10×10cm）內，用25ml TBS室溫洗滌10 min 2次。
2.然后濾膜用25ml封閉緩沖液（每張90mm直徑的濾膜至少15ml）于室溫溫育 30min，以封閉濾膜上的非特異性結合位點。不斷晃動以防濾膜互相粘在一起。
3.每張濾膜置佩特里平皿中，各用3ml含預吸附第一抗體的封閉緩沖液溫育。多克隆第一抗體的經典工作稀釋度為1：100。抗體的這種工作稀釋度可以重復使用到5次并于4℃保存。室溫下用第一抗體溫育至少2h。為了確保濾膜仍然完全浸泡在抗體溶液中，溫育過程中，將平皿放在搖動平臺上。
4.室溫下用25ml TBT洗膜3次，每次10min，并不斷搖動以除去未結合第一抗體。
5.本步驟操作同步驟3。3ml封閉緩沖液內預吸附第二抗體的工作稀釋度通常為1：2000（如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體，Calbiochem公司）。第二抗體工作溶液使用不得超過一次。第二次使用后，第二抗體工作溶液的吸附能力似乎耗盡，經常導致陽性信號的突然丟失。
6.用25ml TBS于室溫下搖動洗膜3次，每次10min以除去未結合的第二抗體。
7.在一個塑料盤內，45ml冷（4℃）的酶反應緩沖液與5ml冷（－20℃）的氯萘酚和50μl H2O2混合。將濾膜一次最多5張放在顯影液內并緩慢攪動。幾分鐘內陽性噬菌斑顯示出紫紅色。
8.如果用Polaroid攝影術（665型膠卷，光圈4.5，快門速度1/15，橙色濾光片）記錄結果，將硝酸纖維素膜放在曝光箱內。
9.為了有助于挑取陽性菌體斑，在拍照的透明膠片上用針頭做相應的標記。

噬菌斑純化
1.用一支消毒的鈍頭巴斯德吸管刺入對應于陽性菌體斑位置的頂層瓊脂，通常很容易從平板上取下薄的環狀頂層瓊脂并用 0.5ml λ-dil重懸于一支Eppendorf管內。
2.挑取的噬菌斑所含的噬菌體顆粒通過劇烈的旋渦振蕩至少1h，從頂層瓊脂釋出，在再次鋪平板前，新制備的噬菌體懸液置室溫下至少1h。
3.在10－3至10－5范圍內稀釋的噬菌體懸液重懸篩選陽性信號。
4.重復步驟1至3，直到從一個原始噬菌體感染在頂層瓊脂上挑取一個陽性噬菌斑為止。

噬菌體增殖
1.為了獲取高滴度的均一噬菌體懸液，每個噬菌斑噬菌體懸液取150μl至250μl，加入E.coli Y1088鋪平板以便擴增。
2.于42℃ 過夜培養后，每噬菌體克隆的一個平板裂解物用7ml λ-dil覆蓋，于室溫持續搖動5h提取噬菌體顆粒。
3.用一支消毒的10ml移液管吸取含噬菌體的上清液，小心避免細胞碎片。加入幾滴氯仿，上清液可作為噬菌體貯存液于4℃無限期保存。
4.每毫升懸液噬菌體原種滴度應在109～1010噬菌體顆粒范圍內。如果噬菌體原種未包含足夠的噬菌體，重復步驟1～3，直至達到足夠的噬菌體滴度為止。
5.必須通過對高度稀釋的噬菌體原種（最多幾百個噬菌體）再次鋪平板測試噬菌體原種的均一性，并用探針重新篩選。至少99％的測試的噬菌體是陽性才能認定測試的噬菌體原種是“均一的”。

（四）噬菌體顆粒純化，DNA分離和亞克隆
1.準備10個LB平板，用E.coli Y1088鋪平板，每個平板至少105個噬菌體。42℃溫育過夜。
2.含噬菌體上清液按前述方法制備，從所有平板收集上清液（10×5ml）。
3.將收集的上清分成兩份 25ml分裝于40ml聚丙烯離心管內。
4.加入25μl RNA酶A和DNA酶I完全消化細菌核酸，于室溫放置30min。
5.每管加入1.46g NaCl并使之完全溶解，室溫放置1h后，于4℃以10 000r/min離心10 min除去細胞碎片。
6.將上清轉入一干凈40ml聚丙烯離心管，加入2.5g PEG，于室溫持續攪拌30min使其完全溶解，置冰上過夜PEG促使噬菌體顆粒形成沉淀。
7.于 4℃以10 000r/min離心10min回收沉淀的噬菌體顆粒。
8.棄上清液，小心用軟紙擦拭離心管內壁。
9.將來源于同一噬菌體克隆的兩份沉淀物用4ml SM重懸并收集。用5ml移液管上下抽吸使乳狀沉淀物混勻。
10. 加4ml氯仿，旋渦振蕩30秒，去除 PEG；于4℃以1 600×g離心15min。
11. 將水相（頂層）轉移至一干凈的12ml聚丙烯管內，用SM精確地調節體積至4ml。棄去膠狀的有機相和中間相。
12. 在一支14ml polyallomer超離心管（Kontron公司）內，氯化銫分級梯度的制備從底層至頂層：3ml氯化銫密度為ρ＝1.7；1.5ml（ρ＝1.5）；1.5ml（ρ＝1.45）。
13.每4ml SM噬菌體懸液溶解2g固體氯化銫。
14.將噬菌體懸液置氯化銫分級梯度上，在Backman SW40轉頭或相當的轉頭上以30 000r/min于4℃離心2h。
15. 小心從轉頭內取出離心管，放在強光下。此時噬菌體顆粒清晰可見呈乳狀條帶位于1.5和1.45密度區的中間相。用18G針頭從離心管旁側刺入，以收集噬菌體顆粒。約1.5ml體積。
16.用SM將收集的樣品體積升至6ml，加入固體氯化銫（通常約3g）直到溶液的折射率精確為1.380。樣品體積進一步用氯化銫溶液（0.75g/ml）擴至終體積為9.5ml。
17.噬菌體顆粒通過持續密度滴度再次離心。
18.如步驟15 收集噬菌體顆粒，用于以標準步驟抽提DNA。