穩轉株的制備

實驗原理：

利用哺乳動物系統生產蛋白的方式有兩種：瞬時轉染和穩轉株篩選。通過穩定細胞系構建篩選穩定表達細胞株。針對瞬時轉染，外源基因在短時間轉錄翻譯得到的蛋白量較少，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產成本很高。相對于此，穩定轉染的是將外源基因整合到細胞自身的基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩定轉染表達，同時經過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩定轉染表達蛋白的細胞株，穩轉株生產蛋白穩定性更好，批次差異性更小。

穩定轉染的應用

影響穩定轉染的因素

1、外源基因整合的幾率

決定了穩轉株篩選的簡易程度，有利于穩定轉染細胞的獲得；

2、插入外源基因片段的拷貝數

一般情況下，低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾；

3、整合位點轉錄活躍度

整合位點轉錄活躍度決定了穩轉株篩選細胞后穩轉株中外源基因片段的表達質量；

4、外源基因片段整合到細胞后的穩定性

不同的整合位點決定了外源片段在染色體中的穩定性，有些區域易發生重組或者丟失，從而使穩轉株篩選后出現丟失的現象。

制備穩轉株的實驗步驟

一．準備及預實驗

1、確定細胞系相關信息：需包括如下內容

注：務必保證細胞無支原體污染，方可進行穩轉株構建！

2、查閱慢病毒感染該細胞的MOI值

3、預實驗確定篩選藥物用量：

（1）查閱Puromycin/Blastincidin在目的細胞中穩轉株篩選的致死用量信息；參考查閱得到的數據，確定3個藥物濃度梯度（如沒有相關信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數量增多至6個）；

（2）D0將細胞鋪于6孔板中，使D1細胞融合度約90%；D1按（1）中設置的藥物梯度，加入藥物；

（3）D4換液，并重新加入藥物；

（4）D7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

二．穩轉株篩選及構建

注：以下實驗參數，按1株穩轉株為例描述，實驗需考慮有無對照穩轉株！

1、細胞鋪板：D0將細胞接種于6孔板中（4個孔），使D1細胞融合度約70%

病毒感染：

2、慢病毒上清：分別棄去6孔板中3個孔的0.5毫升培養基、1毫升培養基、2毫升培養基和，分別加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清；

3、純化慢病毒：選3個孔，并可按推薦MOI、大于此MOI及小于此MOI，共三個MOI值，添加慢病毒；

4、觀察感染效率：感染后72小時，觀察感染效率，效率高于80%最佳，最低不應低于40%，選擇1-2個感染效率較好的孔。

5、篩選：

(1)多克隆穩轉株：從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新換液加入藥物。藥物篩選需至少持續14天，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時在上午進行，4-6小時后觀察細胞狀態，如細胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養基。

(2)單克隆穩轉株：建立在獲得多克隆穩轉株基礎上。

A、有限稀釋法：

a.取24個1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培養基；

b.用胰酶將多克隆穩轉株消化（90%融合度，10毫升培養基終止消化），取80微升至第一個EP管中，混合均勻；

注：應使用1000微升槍尖，混合時不要過度吸打，以免破壞細胞。

c.從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中，混合均勻，以此類推。

d.將EP管中的細胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；

e.過夜培養后，觀察第12-24列，尋找只含有1個細胞的孔，并做好標記；

f.培養3-4周，待標記孔中細胞擴增后，消化傳代擴增，即為單克隆穩轉株細胞。

注：培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

B、平板挑取法

a.計數100個多克隆穩轉株細胞，接種于一個10cm培養盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細胞聚團。

b.過夜培養后，觀察并尋找單個細胞的位置，并在盤底做標記；

c.培養2周；

注：培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

d.待標記處的細胞擴增為肉眼可見的白點，使用10微升移液器，調至最大量程，在尖端吸取一點胰酶（約5微升，且尖端為空氣），緩慢滴至白點處，保持槍尖靜置在白點上，且不讓胰酶留出白點所在范圍，1min后，迅速吹打，將消化下的細胞轉移至96孔板中，傳代擴增，即為單克隆穩轉株細胞。約需2-3周。

注：每盤選取20個為宜，在消化時，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之前的相互污染。培養的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。