WesternBlot操作步驟（二）

四、轉膜

以下以使用半干轉膜為例。對于轉印90kd以下的蛋白，轉膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入0.037%的SDS。

1. 在電泳結束前20min開始準備轉膜所需的東西。轉一張膜需準備6張的濾紙（長一般為8.1~8.3cm，寬度根據裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水，所以裁8cm就行）和1張PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1min~2min。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
   

2. 將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取10ml注射器吸滿轉印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。取出凝膠后應注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉膜，前一種方法更加節約材料，但操作稍微麻煩了一點。在加有轉移液的培養皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的PVDF膜和濾紙，平衡10min左右，也是為了除去濾紙和轉移膜中的氣泡以及膠上多余的SDS。

3. 帶上手套，平放轉移槽的底座，依次在石墨電極上疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF膜（此時可在PVDF右上角減去一個角，以辨明轉膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉移效率，如果同時轉好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉移效率）。最后將轉移槽的上蓋扣上，接通電源開始轉膜。由于設備昂貴，第一次操作應向熟手請教，否則短路可能燒壞設備！轉完后立即清洗設備，特別是金屬上蓋，轉膜液特別容易在金屬上蓋上形成結痂，影響設備的正常使用，我們實驗室今年做western的同志因為忽略這一點，轉膜儀燒壞了好幾次。

4. 依據分子量大小電泳15~60min。如果初次轉膜，可以根據一般經驗，即多少kD的蛋白就轉多少分鐘，再根據結果調整時間。之后斷開電源，取出轉移膜進行后繼實驗。

5. 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染。傳統方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合PVDF膜）。將膜晾干備用。使用預染marker話可以看見marker的顏色轉印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉印完全或轉印過頭是不可靠的。

五、免疫雜交反應

1. 將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h即可。如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質。實際經驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。

2. 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以，當然熟練后還可以自由發揮，配制一些自己的復方稀釋液）至適當濃度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀釋倍數為1:200，1:500，1:1000，具體需要預實驗進行摸索，用后可回收重復用2~3次，但回收重復利用的效果如何就要看抗體的質量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術室的病理袋，質量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（40~80元一個）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后轉移到室溫下再孵育1h（或者4°孵育過夜），用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗幾次，比如4次，每次5min。

3. 在培養皿內加入二抗稀釋液（10ml足夠了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進行化學發光反應。選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時間應嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。

六、化學發光（ECL）　

現在工作臺上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜放在保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要患槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應1~2min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉移到在X片夾中預先鋪好的保鮮膜上一側，把另一側翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。

七、凝膠圖象分析

將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值，比如bio-rad的Quantity One。

主要參考資料：
1、WB實戰指南+正確使用Quantity One定量 by jacqueslm2001 http://protein.dxy.cn/bbs/topic/17898080
2、Abcam的western新手指南 http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/?WB-beginner.pdf
3、土豆網的western blot視頻 上海交大出品 http://www.tudou.com/programs/view/MjbxGQJ2kRU/
4、《分子克隆實驗指南》精編版 化學工業出版社
5、《抗體技術實驗指南》科學技術出版社
6、milipore的western blot的優化方案 http://www.dxy.cn/upload/2010/millipore/index.html
7、Western blot步步看(網絡流傳最廣的資料) 作者不詳 http://protein.dxy.cn/bbs/topic/21950829
8、Bio-rad 蛋白印跡手冊 http://www.dxy.cn/bbs/thread/21360641#21360641
9、窮人的勞斯萊斯-我的五年western blot體會 by seagatehttp://protein.dxy.cn/bbs/thread/18102961#18102961
附：Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的時間規劃）
前期準備：蛋白已經定量，各樣本已經稀釋到某固定濃度，已經和SDS loading buffer混合，已經分裝好，保存與-20°。頭天下午或晚上配膠，分離膠和濃縮膠一起配好，帶上梳子，放入潮濕的自封袋內放入4°冰箱備用。
8:00 從冰箱里取出蛋白樣品，用PCR儀95度加熱5min。混合均勻并離心。
8:30 取出昨晚配好的膠，組合，加電泳液。在電泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的槍加樣。
9:00 開始電泳。恒流30mA一般1個小時足夠了。
9:30 開始準備轉膜用的濾紙和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的寬是固定的，所以如果要裁膠的話可以先大概估計一下。
10:10 電泳結束（假設電泳用了70分鐘），起開玻璃板，裁出膠上所要的條帶，如果整塊膠轉就更方便了。把膠放在盛有轉膜緩沖液的培養皿里。
11:00 轉膜開始（這里裁紙和鋪三明治還是比較費時間的，我一般要用30分鐘到50min，所以這里要抓緊時間）。
12:00 轉膜結束（這里按60min的半干轉的時間來計算）。開始封閉1h。
13:00 封閉結束，開始孵育一抗（在這里你可以選擇一抗孵育過夜，如果不過夜的那一天就能結束），如果不過夜的話我一般選擇37° 1h然后在室溫（23°左右）再1h。
15:00 一抗孵育結束。TBST洗滌3*10min或者5*6min。
15:30 開始孵育二抗。室溫1h足夠了。
16:30 二抗孵育結束。TBST洗滌3*10min或者5*6min，這里推薦采用5*6min。
17:00 ECL發光，拍照，結束戰斗了。