發布時間：2019-04-07 15:08 原文鏈接： T細胞克隆的建立

實驗步驟	基本方案 1 產生和維持同種反應性 T h 和 CTL 克隆盡管同種反應性 T 細胞可以從未刺激的脾細胞或淋巴結細胞中產生，但如果細胞在初次混合淋巴細胞（M L C ) 中第一次被同種抗原刺激，反應細胞的得率會更高。見以下介紹。材料同種反應性小鼠脾臟 T 細胞 V H B S S (可選使用） V D M E M -20 完全培養基經照射的（2000rad，單元 2. 1 1 ) 同種異基因型小鼠脾臟 T 細胞生長因子： M L C 或 Con A 刺激的細胞上清（見輔助方案 1 或 2)，重組細胞因子 9 6 孔平底培養板（Costar) 2 4 孔細胞培養板（Linbro， Costar 1 . 在體外用同種異型抗原致敏同種反應性 T 細胞 10?M d (見輔助方案 2 , 步驟 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶液（即與小鼠血清等滲的溶液）。 2 . 準備再次刺激用的 M L C (見輔助方案 2 , 步驟 3)，培養 36?48 h 。 3.將經照射（2000rad) 的同種異型脾 T 細胞，用 D M E M -2 0 培養基調節細胞濃度為IO⁷ 個細胞/m l ，每孔 100ul 加入到 9 6 孔平底板中。 4 . 從再次刺激用的 M L C 體系中收集 T 細胞（步驟 2)，重懸于 D M E M -20 中并計數(附錄 3A )。 5.將重懸的 T 細胞用 M L C 或 Con A (作為細胞因子）激活的上清稀釋到 1?1 0 個細胞/m l ， 50ul 每孔加入步驟 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培養 4d。 6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培養基。培養 7 ?IOd 直到在倒置顯微鏡下可在一些孔中觀察到有明顯的細胞集落形成。 7a. 用 51C r 微量釋放實驗檢測細胞毒活性：用 51C r 微量釋放實驗檢測細胞毒活性（Engers and Fitch; 單元 2. 10)，區分同種反應性 C T L 和 T h 細胞。如果細胞毒活性試驗顯示陰性，進一步用單元 2. 1 1 所示的增殖試驗檢測 T h 細胞的存在。 7b. 檢測 IL-2 或 IL-4 的產生：用抗原（單元 5. 1 ) 再次刺激檢測 IL-2 或 IL- 4 的產生，或用表面表達 C D 4 或 C D 8 (單元 4. 1 和單元 4. 2 ) 篩選。 8 . 鑒定同種反應性 T 細胞克隆是否具有應有的特征（特異的細胞毒活性和特異性細胞因子的產生）。 9 . 按如下方法維持克隆的細胞：從原來的 9 6 孔板轉移 IOOiUl 細胞懸液（含 2. 5 X IO⁴?I X lO⁵ 個細胞）到 0. 9m l 含 6 X lO ⁶ 個經照射的同種異型脾細胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔細胞培養板，補加 D M E M -20 培養基使終體積達每孔 I.5m l 。每隔一周按此種方法傳代細胞。基本方案 2 用可溶性蛋白抗原誘導 T h 克隆不要臆斷 T C R 轉基因小鼠是單克隆性的，因為它們會含有內源性 T C R 基因重排的細胞。材料 m a n ， 1982)。 9.一旦獲得足夠數量的細胞，通過檢測 IL-2、 IL-4 和 IFN-Y 的產生（單元 5 . 1 ) 鑒定新產生的克隆。生長因子來源的條件培養基的制備在選擇一種條件培養基之前必須考慮的一個重要因素是，每種培養基包含不同的細胞因子譜。輔助方案 1 制備刀豆蛋白 A 活化的上清（C c m A 上清）輔助方案 2 制備混合淋巴細胞培養上清（M L C 上清）輔助方案 3 制備 P M A 激活的 E L -4 淋巴瘤細胞上清（E L -4 上清）輔助方案 4 用顯微操作的方法克隆與有限稀釋法比較，更推薦使用重復顯微操作的方法培養克隆，它是確保克隆形成能力的唯一方法。附加材料（其他材料見基本方案 2) 微毛細管（如微量血細胞比容管， BectonDickinson) 展開

實驗步驟

基本方案 1 產生和維持同種反應性 T h 和 CTL 克隆

盡管同種反應性 T 細胞可以從未刺激的脾細胞或淋巴結細胞中產生，但如果細胞在初次混合淋巴細胞（M L C ) 中第一次被同種抗原刺激，反應細胞的得率會更高。見以下介紹。

材料

同種反應性小鼠脾臟 T 細胞

V H B S S (可選使用）

V D M E M -20 完全培養基

經照射的（2000rad，單元 2. 1 1 ) 同種異基因型小鼠脾臟 T 細胞

生長因子： M L C 或 Con A 刺激的細胞上清（見輔助方案 1 或 2)，重組細胞因子

9 6 孔平底培養板（Costar)

2 4 孔細胞培養板（Linbro， Costar

1 . 在體外用同種異型抗原致敏同種反應性 T 細胞 10?M d (見輔助方案 2 , 步驟 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶液（即與小鼠血清等滲的溶液）。

2 . 準備再次刺激用的 M L C (見輔助方案 2 , 步驟 3)，培養 36?48 h 。

3.將經照射（2000rad) 的同種異型脾 T 細胞，用 D M E M -2 0 培養基調節細胞濃度為IO⁷ 個細胞/m l ，每孔 100ul 加入到 9 6 孔平底板中。

4 . 從再次刺激用的 M L C 體系中收集 T 細胞（步驟 2)，重懸于 D M E M -20 中并計數(附錄 3A )。

5.將重懸的 T 細胞用 M L C 或 Con A (作為細胞因子）激活的上清稀釋到 1?1 0 個細胞/m l ， 50ul 每孔加入步驟 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培養 4d。

6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培養基。培養 7 ?IOd 直到在倒置顯微鏡下可在一些孔中觀察到有明顯的細胞集落形成。

7a. 用 51C r 微量釋放實驗檢測細胞毒活性：用 51C r 微量釋放實驗檢測細胞毒活性（Engers and Fitch; 單元 2. 10)，區分同種反應性 C T L 和 T h 細胞。如果細胞毒活性試驗顯示陰性，進一步用單元 2. 1 1 所示的增殖試驗檢測 T h 細胞的存在。

7b. 檢測 IL-2 或 IL-4 的產生：用抗原（單元 5. 1 ) 再次刺激檢測 IL-2 或 IL- 4 的產生，或用表面表達 C D 4 或 C D 8 (單元 4. 1 和單元 4. 2 ) 篩選。

8 . 鑒定同種反應性 T 細胞克隆是否具有應有的特征（特異的細胞毒活性和特異性細胞因子的產生）。

9 . 按如下方法維持克隆的細胞：從原來的 9 6 孔板轉移 IOOiUl 細胞懸液（含 2. 5 X IO⁴?I X lO⁵ 個細胞）到 0. 9m l 含 6 X lO ⁶ 個經照射的同種異型脾細胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔細胞培養板，補加 D M E M -20 培養基使終體積達每孔 I.5m l 。每隔一周按此種方法傳代細胞。