RNA的甲醛變性電泳實驗

用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核內小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不見的。故可通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果。

植物總RNA

加樣運載緩沖液 TAE Buffer 甲醛凝膠電泳緩沖液 甲醛 甲酰胺

電泳裝置 外透射觀測儀

一、材料、試劑和儀器
 

1.  材料：植物總RNA 5-10 ug
 

2.  試劑
 

（1）加樣運載緩沖液（Loading buffer）

50% 甘油

1 mmol/L EDTA （pH8.0）

0.25%溴酚藍

25%二甲苯氰FF
 

（2）10xTAE Buffer
 

（3）5x甲醛凝膠電泳緩沖液：

0.1 mol/L MOPs （pH7.0）

40 mmol/L乙酸鈉

5 mmol/L DETA（pH8.0）
 

（4）甲醛，甲酰胺
 

3.  儀器：電泳裝置，紫外透射觀測儀
 

二、實驗程序
 

1.  甲醛變性的瓊脂糖（Agarose） 凝膠的配制
 

在250 mL的錐形瓶中準確稱量2 g Agarose （Sigama），再加20 mL 10xTAE Buffer，144 mLDEPC處理過的雙蒸水，微波爐中化膠，待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5 ug/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。
 

2.  RNA的甲醛變性電泳
 

（1） 樣品制備

RNA總量：10 ug

5×甲醛凝膠電泳緩沖液：4 ul

甲醛： 3.5 ul

甲酰胺：10 ul

加入無菌離心管中混合，95℃水浴變性2 min（或55℃，15 min），取出后放入冰中冷卻。
 

（2） 加入2 ul無菌的DEPC處理的加樣運載液。（使用加樣運載液的目的有三： 增大樣品密度，以確保DNA均勻進入樣品孔內；使樣品呈現顏色，便于加樣操作；能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時，溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4 kb 的雙鏈線狀DNA相同。）
 

（3）將膠板浸沒在1x甲醛凝膠電泳緩沖液中，點樣前5 V/cm預跑5 min。點樣后3-4 V/cm電泳。
 

（4）電泳結束后（溴苯酚藍遷移到約8 cm處），紫外燈下觀察， 照相。

每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg總RNA進行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）；如待測RNA含量極微，每個泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。

每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg總RNA進行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）；如待測RNA含量極微，每個泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。