PCR技術以其自身巧妙的原理有與眾不同的特點,高特異性、高敏感性及簡便快捷使其成為基因診斷首選的技術之一。
一、高特異性,PCR擴增嚴格遵守堿基配對原則的半保留復制。半保留復制是世界上最嚴格的復制方式之一,其新合成的子鏈與模板形成完全互補的鏡像結構,從而充分保證了復制的準確性。另外,由于堿基互補原則,只有當引物與目的基因完全互補時,反應體系中的引物才能與模板產生復性,引物的延伸才得以進行,因此引物與模板的互補是復制的最基本條件,這從另一方面規定了PCR反應的高特異性。在生物界中,某種基因總有它最保守的、最具特征性的基因區段,它是某些生物,或某些型、亞型等功能分型所特有的。若能正確地選擇這一區域作為擴增的目的基因,便可以充分地保障PCR檢測的高度特異性。
二、高敏感性,在PCR反應中模板DNA以指數級迅速增加,擴增反應前期進入以指數級迅速增加,擴增反應后期進入平臺反應期,一般經過30個循環即1——2小時內可以將靶序列增加百萬倍以上,可以將微量的目標物(fg DNA)檢測出來。過去采用的一些微量檢測法,如酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和放射免疫分析(RIA)其靈敏度分別為ng級和pg級,而PCR可達fg級,理論上可以檢出病原體的單拷貝基因的存在。
三、簡便快捷,Taq酶的使用使PCR技術可以自動化完成,各種高效熒光定量PCR儀相續問世使PCR操作可以在基層單位的實驗室中順利完成。在PCR的實際應用中,許多技術得到改進,擴增反應體積減少,多種成分預先混合減少加樣步驟,這些簡化步驟大多不影響PCR的擴增效果。特別是本公司率先研制的單管單人份的PCR試劑,使操作者節省時間精力,而且又不易污染,充分滿足了臨床快速診斷的要求PCR技術對樣品要求低,不必嚴格純化模板DNA,幾乎所有的臨床樣本都能用于PCR擴增,本公司設計的一步法提取模板使臨床PCR檢測更加簡便易行。
PCR局限性,由于Taq酶缺乏3’端到5’端外切酶活性,因而不能糾正反應中發生的錯誤的核苷酸摻入,復制的新的DNA鏈中有一定程度的錯配堿基,估計錯配率為9000個核苷有一個錯配,41000個核苷酸可能導致一次碼移位。然而錯配堿基有終止延伸傾向,這使錯配的DNA片段不會進一步擴大。另外,PCR要求比較嚴格,容易出現實驗污染或操作污染而出現假陽性結果。同時如果擴增儀溫度不準確,反應液處理不好導致PCR抑制物進入反應體系又會出現假陰性結果。因此在開展PCR工作之前,有關人員最好能經過系統的學習及規范化的基本技能培訓過程。