結論
這些結果表明紅外雙光子和二次諧波產生顯微成像對于無毒害的時間分辨的細胞行為調查的深層組織成像尤其有利。作為與其它脈沖飛秒激光系統相比的優勢，如Ch:forsterite (1230 nm) 和 Fianium fiber (1064 nm) 激光器，OPO產生的波長是可調諧的，適用于以一種彈性方式在它們的激發峰段對紅色和近紅外熒光團進行激發。由于沒有分辨率方面的主要損失，1100nm到1300nm波長范圍非常適用于紅色和近紅外熒光團，以及遺傳編碼的紅移熒光蛋白(DsRed2, mCherry, TurboFP) 的雙光子激發和寬帶SHG，然而與NIR激發相比，它的限制性水分吸收倍增了間質組織和細胞豐富組織的穿透深度。
強化IR-MPM的深入發展包括進一步的紅移遺傳編碼熒光蛋白的構造；用于識別具有類似發射光譜的多光子熒光IR激發的熒光壽命成像研究；與光學相干層析的結合，用于預選感興趣的研究區域；合適的光學器件的補償。對于組織中的深層成像后者尤其重要，因為細胞膜，脂肪沉著體，及類似物造成的折射率局部改變削弱了激發波前，并因此顯著地削弱PSF。在這個雙光子顯微鏡中，不只是導致了圖像質量的下降，而且導致了熒光的重大損傷，因為信號依賴于激光能量的平方。使用合適的光學器件和對給定深度進行一個單獨的形狀校正將會補償樣品產生的80%的畸變。
Figure 6 一個固定的淋巴結內樹突細胞（DC）的3D重構。在腘窩淋巴結抑制前24小時，將同源未成熟的CMTR陽性DC注入Balb/C小鼠的腳掌中。 (a) 一個880nm激發波長的重構和(b)作為穿透深度功能的歸一化的紅色熒光(虛線區域的Z面測得). (c) 1100nm激發波長的重構(d)400–700 μm深的深層T細胞區域處的XY切片。激發能為 110 mW (1100 nm) 和 180 mW (880 nm). 標尺，100 μm.
利用三次諧波產生THG和OPO激發CARS（相干反斯托克斯現象）的IR多光子顯微成像對于原生狀態的細胞和組織結構成像非常有用。三次諧波產生THG是一種由三階非線性過程產生的類似SHG的非線性光學顯微技術。因為非線性地依賴于激發能，THG具有內在光學切片的特點。它與近紅外波長（1-2um）混合時非諧振的特性使得這種技術對于生物和非生物樣品成像非常有趣。
Nd:vanadate或者Ti：Sa激光器與泵浦OPO共同使用將充分使得CARS成為一個原生狀態細胞和組織成像的有力工具。因此，Ti：Sa激光作為泵浦光束，而OPO激光作為CARS非線性過程的Stoks光束，適用于活細胞的脂類代謝和細胞器運輸方面的研究。
同時使用綠色和紅色熒光團將會從當前的Ti：Sa和OPO系統發展中得到很多益處。最新的Ti：Sa激光器超過4W的一般特征性能量輸出可以提供給兩個激發光束幾個100mw的能量。最后，一個新的OPO晶體的產生將會在一個寬范圍調諧泵浦光束帶寬因此支持綠色和紅色熒光團的在各自激發峰同時激發。總之，越紅越好的普遍觀點對于深層組織雙光子顯微鏡在生物醫藥研究的寬的應用范圍內是正確的。
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1 University of Wu¨ rzburg, Rudolf-Virchow Center for Experimental Biomedicine and Department of Dermatology, Venerology, and Allergology, Josef-Schneider-Strasse 2, 97080 Wu¨ rzburg, Germany
2 LaVision BioTec GmbH, Meisenstrasse 65, 33607 Bielefeld, Germany
3 AntiCancer, Inc., 7917 Ostrow Street, San Diego, CA 92111 and Department of Surgery, University of California, San Diego, 200 West Arbor Drive, San Diego, CA 92103-8220, USA
4 Microscopical Imaging Centre, Department of Cell Biology, Nijmegen Center for Molecular Life Science, Radboud University Nijmegen Medical Centre, P.O. 9101, 6500 HB, Nijmegen, The Netherlands
Corresponding author: Friedl, Peter (P.Friedl@ncmls.ru.nl)