H33342釋放法檢測單核巨噬細胞的胞毒作用

實驗概要

本實驗利用H33342釋放法檢測了單核-巨噬細胞的胞毒作用。H33342(Hoechst33342)為DNA的特異性熒光染料，可用其標記腫瘤細胞以檢測單核細胞對腫瘤細胞的殺傷效應。被損傷的靶細胞DNA斷裂后，H33342釋放到上清液中，采用微量熒光儀可定量測定上清液中的熒光強度。效應細胞的殺傷活性與靶細胞釋放的熒光強度呈正相關。該方法同樣可用于CTL、NK、LAK或TIL等殺傷細胞的活性檢測。

主要試劑

H33342

主要設備

1. 微量熒光"W"測量板(德國Dynatech公司產品)

2. 用自動微量熒光分析儀(Micro-FluoDynatech)

實驗材料

靶細胞(L929細胞株，對單核細胞的殺傷活性敏感)

實驗步驟

1. 從單個核細胞中采用粘附法分離的單核細胞，經非特異性酯酶(ANAE)和臺盼藍染色，細胞純度應>90％，細胞活力應>95％；

2. 收獲靶細胞并將細胞濃度調至1×10⁷/ml；

3. 加入終濃度為10μmol/L的H33342，置37℃標記2h；

4. 用DMEM液離心洗滌3次，重懸浮于完全DMEM培養液中；

5. 將效應細胞和標記的靶細胞按一定比例(一般為20-50∶1)加入96孔圓底培養板200μl/孔，作3個復孔；置37℃5％CO₂溫箱培養20h；

6. 離心后從每孔取150μl上清液，分別加至微量熒光"W"測量板；

7. 用自動微量熒光分析儀(Micro-FluoDynatech)測定3孔的OD值，求得平均值。激發波長為360nm，發射波長450nm。每次試驗同時作下列對照:自發釋放值:測定單獨培養的靶細胞上清液熒光強度。最大釋放值:測定靶細胞用1％Triton X-100裂解后的熒光強度。