xjktony
擴增模板的GC 含量為66％,也不算很高,我做過更高的GC 含量(80%)的PCR.對于 這種高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二級結構的影響,當然現在也有專門這種PCR Buffer賣.
vanny
寶生物有這種做高GC含量的酶和buffer，稱為LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果還不錯。
westernblot
你用DMSO5％加到里面，60％應該不是算高的，如果實在不行，就用advantage 2 high GC taq polymeras.（clontech), 效果好，就是貴了點。
我用的退火溫度為60度可見模糊片段，但58度就只有引物二聚體了，
你用高溫變性，向95度，5min,后加入taq酶，其余度循環中間用95度，15s，如果TM值高過60，可以考慮用65－62度，增加循環數。
changle
可以用雙溫法試試，比如35個循環，總變性之后，前五個循環雙溫即沒有延伸，后三十個循環三溫，具體溫度根據引物Tm值定。我試過效果不錯。
mcli
如果基因的5’端含有豐富的GC堿基，設計的PCR引物Tm值很高，用普通PCR很難理想地擴增出此基因。用熱啟動（hot start）和降落-PCR，能取得了較好效果。在PCR開始時加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶，并延長起始變性時間如95℃變性15 min，能使模板DNA完全變性，以便提供最大數量的引物配對位點，可避免引物二聚體和非特異性配對。
PCR反應過程中，首先在高于引物Tm值的72℃左右擴增幾個循環，然后把退火溫度逐漸降到兩引物的Tm值附近，在隨后的循環中，對退火溫度進行梯度實驗。這樣能保證第一引物-模板雜交事件發生在最互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。
盡管退火溫度最終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何級擴增，在剩下的循環中處于超過任何非特異PCR產物的地位。因此，降落-PCR既能增加反應特異性，又能提高PCR產物的產量。
為你設置循環條件為：①95℃變性15 min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火溫度每循環降低2.0℃，72℃ 45s，5個循環；③94℃ 45s，設置退火溫度梯度從55℃到65℃ 30s，72℃ 45s，30個循環；④72℃延伸10min。
agct
幾點建議：
先優化反應條件，GC豐富的序列，退火溫度其實也不用刻意加高
主要是變性溫度，預變性96度5分鐘然后再加酶（熱啟動）
一般循環的變性溫度用95度比94好，還不行還可以再加高
還有DMSO和甘油，各加到5％就足夠了，光加DMSO有的時候會使酶的半衰期下降
mcli：
引物GC含量分別高達70%以上時，用普通PCR很難理想地擴增出此基因。因為G、C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，故模板較難打開，在常規變性溫度下，DNA模板變性不完全，同時由于單鏈的G＋C豐富區易于自身互補配對形成穩定的發夾環二級結構，而使PCR引物難于結合到模板上，DNA聚合酶也難于延伸或停止延伸，結果常出現嚴重的非特異性條帶，甚至擴增不出靶基因。
在擴增高含量GC的基因時，可對PCR條件進行幾個方面的優化：
1、熱啟動（hot start）PCR：
使用熱啟動PCR，一方面通過擴增前的加熱，使雙鏈模板充分解鏈，另一方面，通過高溫啟動反應，促進引物的特異性復性與延伸；增加有效引物的長度，提高了反應的特異性與靈敏性，并減少了引物二聚體或多聚體的形成，從而能提高GC富集區的擴增效率。
我們采用Qiagen公司提供的Hotstar Taq DNA聚合酶，此酶含有一種熱不穩定性保護抗體（ Taqstart antibody），該抗體在低溫時與Taq酶結合，抑制其活性，當反應體系達到一定的溫度后，這種熱不穩定性保護抗體就從Taq酶上脫落下來，Taq酶得以恢復活性。我們在PCR開始時就加入Hotstar Taq DNA聚合酶，并延長起始變性時間如95℃變性15 min，能使模板DNA完全變性，以便提供最大數量的引物配對位點，避免了引物二聚體和非特異性配對。
2、降落（TD）-PCR：
PCR開始時的退火溫度高于估計的Tm值，隨著循環的進行，退火溫度逐漸降到Tm值并最終低于這個水平。退火溫度選擇應根據引物的長度及G+C的含量，在Tm值允許的范圍內，較高的退火溫度可大大減少引物和模板的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。
首先在高于引物Tm值的溫度擴增幾個循環，然后把退火溫度逐漸降到兩引物的Tm值附近，在隨后的循環中，對退火溫度進行梯度實驗。這樣能保證第一引物-模板雜交事件發生在最互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。盡管退火溫度最終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何級擴增，在剩下的循環中處于超過任何非特異PCR產物的地位。因此，TD-PCR既能增加反應特異性，又能提高PCR產物的產量。
3、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、模板等也影響PCR的產量及產物特異性。它們的濃度過高反應特異性降低，過低則PCR產物產量減少，即高特異的反應條件可能與高產量的反應條件并不一致。