試劑、試劑盒 ATP[y-32P]ATPT4多核苷酸激酶乙酸銨乙醇酚 氯仿氯仿 異戊醇NaOAcT4 DNA連接酶酚異丙醇重蒸水Sepharose CL-2B溴化氰NN-二甲基甲酰胺NaOH磷酸鉀KClCNBr-活化的Sepharose*.4BHClT4 多核苷酸激酶緩沖液TE接頭-激酶緩沖液乙醇胺-HCl層析柱的儲存緩沖液
儀器、耗材 SpeedVec 旋轉濃縮器
實驗步驟
材料與設備
ATP(20 mmol/L;pH7.0)
[y-32P]ATP(5uCi)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸銨 (10mol/L)
乙醇（100% 及 75%;v/v)
酚/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/異戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
NaOAc(3mol/L)
T4 DNA 連接酶（Stratagene)
酚（經 TE 平衡）
異丙醇（2-丙醇）
重蒸水
Sepharose CL-2B(pharmacia Biotech,Inc.)
溴化氰（CNBr)(Aldrich Chemical Co.,C9149-2)
N，N-二甲基甲酰胺
NaOH(5mol/L)
磷酸鉀（lOmmol/L 及 lmol/Lt 均為 pH8.0)
KCl(1mol/L)
CNBr-活化的 Sepharose*.4B(Pharmacia Biotech,Inc.)
HCl(1 mmol/L)
SpeedVec 旋轉濃縮器（Savant Instruments,Inc.)
試劑
T4 多核苷酸激酶緩沖液（10X)
TE
接頭-激酶緩沖液（10x)
乙醇胺-HCl (1mol/L;pH8.0)〔用 HC1 將 1mol/L 乙醇胺 (游離堿) 調至 pH8.0〕
層析柱的儲存緩沖液
(配方，見"試劑的配制"，P.131—138)
操作程序
寡核苷酸的 5'-磷酸化
1）配成下列反應混合物：
DNA(溶于 TE 的每份寡核苷酸為 440ug；即總 DNA880ug）65ul
T4 聚核苷酸激酶緩沖液（10X)10ul
總體積：75ul
2) 互補 DNA 雙鏈變性后再退火：88°C 孵育 2 min，65°C 孵育 10 min,37°C 孵育 10 min，最后室溫解育 5 min。
3) 合并下列溶液：
DNA(由上步得到）75ul
ATP(20 mml/L;pH7.0；含約 5uCi[γ-32P]ATP)15ul
T4 多核苷酸激酶 (100U)10ul
總體積：100ul
4)37°C 孵育 2 h, 加 50ul 10mol/L 乙酸銨及 100ul H20, 使終體積達 250ul。
5)65°C 加熱 15 min, 使激酶失活。
6) 混合物降至室溫。加 750ul 100% 乙醇，顛倒混勻。用微型離心機于室溫下髙速離心 15 min, 沉淀 DNA。
7) 棄上清，加 225ulTE, 震蕩，溶解沉淀 c
8) 加 250u1 1:1 的酚/氯仿，震蕩混合 1 min, 高速離心 5 min, 使兩相分離。
9) 將上層液體轉移至一新管，加 250ul 24:1 氯仿/異戊醇，震蕩混合 1min, 高速離心 5 min, 使兩相分離。
10) 將上層轉移至一新管中，加 25ul 3mol/LNaOAc，震蕩混合。
11) 加 750ul 100% 乙醇，顛倒混勻，高速離心 15 min, 沉淀 DNA。
12) 棄上清，加 800ul 75% 乙醇，震蕩混合，高速離心 5 min。
13) 棄上清，SpeedVac 旋轉濃縮器干燥。