實驗方法原理 在pH值為8.0~8.3時,核酸分子堿基幾乎不解離,磷酸全部解離,核酸分子帶負電,在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物,在分子篩的作用下,使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異,從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料(如EB)后,在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。
實驗材料 質粒DNABAC
試劑、試劑盒 瓊脂糖溴酚藍溴化乙錠
儀器、耗材 制膠板電泳槽紫外透射儀
實驗步驟
1. 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好,水平放置在工作臺上;
2. 調整好梳子的高度;
3. 稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中,在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解,冷卻至45-50篊時倒入制膠板中;
4. 凝膠凝固后,小心拔去梳子,撕下膠帶;
5. 將電泳樣品與溴酚藍混合后將樣品依次點入加樣孔中;
pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚藍2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后點樣;
6. 將制膠板放入電泳槽中,加入電泳液,打開電泳儀,使核酸樣品向正極泳動;
7. 電泳完成后切斷電源,取出凝膠,放入0.5礸/ml的溴化乙錠(EB)溶液中染色10-15min,清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結果,并照相記錄。
注意事項
1. 影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素:
(1)DNA分子大小與遷移速率U與logN成反比(N為堿基對數目)。分子大小相等,電荷基本相等(DNA結構重復性)。分子越大,遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快(超螺旋>線性DNA)
(2)膠濃度,U為遷移率,U0t 瓊脂糖濃度:logU=logU0 Kr 為膠濃度,Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度,分辨不同范圍的DNAt為DNA的自由電泳遷移率,
(3)DNA構象:一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>單鏈開環。當條件變化時,情況會相反,還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。
(4)所加電壓:低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好,凝膠上所加電壓不應超過5 V/cm
(5)堿基組成與溫度:一般影響不大4 -30 ℃
(6)嵌入染料的存在:降低線性DNA遷移率,(不提倡加在電泳液中)
(7)電泳緩沖液 (0.5×TBE)的組成及其離子強度影響DNA的遷移率,無離子存在時,核酸基本不泳動,離子強度過大產熱厲害,熔化凝膠并導致DNA變性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA pH8.0)。
2. 溴化乙錠(EB)為致癌劑,操作時應戴手套,盡量減少臺面污染。
3. 電泳指示劑:核酸電泳常用的指示劑有兩種,溴酚藍(bromophenol blue, Bb)呈藍紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈藍色,它攜帶的電荷量比溴酚藍少,在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。