在分子生物學研究中，DNA
的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和
Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生
A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA
序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA
聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在
G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
第一節 非同位素銀染測序系統操作技術
一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA 測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。
銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。
此外，SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，
減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA 聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA 聚合酶是一種Taq DNA 聚合酶的修飾產品，對于雙鏈DNA 模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR
產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃
退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由于本系統采用熱循環裝置，與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA
產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03--2pmol模板DNA ，隨模板種類而定。(2).
在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA (dsDNA )模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環也有助于消除由于線性dsDNA
模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA 模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
二、材料 待測已提純的DNA ，可為單鏈，也可為雙鏈。
三、設備 高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA 測序試劑盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris，0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g
Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ?2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于 4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶于2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶于2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
五、操作步驟：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA 模板量，每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點：
（1） DNA 的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定，樣品應與已知量DNA 一起電泳。
（2） 分光光度法對于很多DNA 提取物包括質粒小量制備來說，并不能給出一個可信的DNA 濃度估計，混雜的染色體DNA 、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA 濃度。
（3） DNA 制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳后DNA 樣品的前面，并不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。
2. 對于每組四個測序反應，在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA (4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。
7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA 測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA 的量一般按下面要求加入：
| 模板種類/長度 | 模板量 |
| 200bp (PCR產物) | 16ng(120fmol) |
| 3000-5000bp（超螺旋質粒DNA ) | 4mg (2pmol) |
| 48000bp(λ，粘粒DNA ) | 1mg(31fmol) |
由于超螺旋質粒產生的信號比松馳的線性雙鏈DNA 弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n，其中n為引物堿基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA :1pmol=(6.6×10-4 mg)×n，其中n為模板堿基對數
ssDNA :1pmol=(3.3×10-4 mg)×n，其中n為模板堿基數