(一)
測序模板制備
測序模板應為單一來源DNA，包含質粒DNA、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增產物回收的DNA等。測序模板制備過程中應防止外源DNA污染，避免外部因素對測序模板的破壞和降解。
1.質粒DNA的制備
樣品經平板培養挑取用質粒轉化的單菌落接種到含有適當抗生素的培養基中，振蕩培養獲得細菌培養物，分離質粒DNA作為測序模板。
通常釆用十二烷基硫酸鈉(SDS)堿裂解法從細菌培養物中分離質粒DNAO采用電泳或限制性核酸內切酶消化的方法對所獲得的質粒DNA進行完整性鑒定，一般通過260nm波長處的吸光度值(A260)、260nm與280nm波長處的吸光度比值(A260/A280)分別檢測質粒DNA的濃度和純度。
2.PCR擴増產物DNA的制備
樣品經DNA提取、PCR擴增和產物回收后，制備的目的DNA片段作為測序反應的模板。
在DNA提取前，動植物類中藥材需采用適宜的方式去除外源污染；動物源性原材料與輔料的取樣應有代表性，固體樣品應研磨至細粉，液體樣品應充分混勻；微生物、生物制品生產檢定用菌毒株和動物細胞基質需獲得純培養株。在DNA提取過程中需針對不同樣品采用相應的提取方法，所獲得的DNA應具有合適的濃度、純度和完整度。DNA提取效果依據不同樣品類型來確定，一般通過A260、A260/A280分別檢測DNA的濃度和純度。
提取的DNA經PCR擴增達到指數級倍增，退火溫度、最佳循環數可根據檢測要求和檢測對象確定。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈或藍光（一般用470nm波長）照射下迅速切取目的條帶所在位置的凝膠塊，采用PCR產物凝膠回收試劑盒進行回收。PCR產物也可不經瓊脂糖凝膠電泳，直接采用PCR產物純化試劑盒進行回收。回收的PCR擴增產物DNA一般通過A260、A260/A280對其濃度和純度分別進行檢查。
（二）DNA測序
制備的測序模板經測序反應和產物純化后獲得不同長度的寡核苷酸，進行自動化測序。
1.測序反應和產物純化
測序反應為單鏈模板的線性擴增，即在測序反應體系中只加入一條測序引物。反應體系包含緩沖液、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、熒光標記的ddNTPs、測序引物、測序模板和滅菌的純化水。測序引物由測序模板的來源信息確定。
根據目標序列的長度選擇合適的測序反應程序，并采用適宜方法對測序反應的產物進行純化，通常采用乙醇醋酸鈉法，獲得不同長度的熒光標記寡核苷酸。
2.上機測序
將不同長度的熒光標記寡核苷酸加入上樣板，根據所使用的熒光標記方法、毛細管長度和電泳膠的種類選擇相應的運行和分析模式，不同長度的熒光標記寡核苷酸由小到大依次通過檢測窗口，激光器發出激光并激發ddNTPs上的熒光標記，電荷耦合元件圖像傳感器（charge-coupled device，CCD）記錄熒光信號，根據熒光信號識別為對應的堿基和質量值（Q值），獲得DNA測序峰圖（trace file）。
（三）結果分析
1.測序峰圖質量評估
基于堿基Q值對測序峰圖的質量進行評估，依據供試品類型確定測序峰圖的質量要求，對于質粒DNA測序峰圖，去除引物后峰圖的平均Q值需大于30，Q值小于20的堿基數占總堿基數的百分比需小于1%；對于PCR產物測序峰圖，除滿足上述要求外，還需去除兩端低質量序列，且剩余測序峰圖的長度需大于PCR產物長度的50%。不合格的測序峰圖不能用于序列拼接和結果判定。
2.序列拼接
雙向測序峰圖使用相應的軟件進行序列拼接，正反向測序峰圖的重疊區域（overlap）需大于目的DNA序列長度的50%，不一致堿基（替代、插入或缺失）的確定依據Q值的高低，但占總堿基數的比例需小于1%。
3.拼接結果質量評估
依據供試品的類型和結果判定標準，對拼接獲得的一致性序列（consensus sequence）進行質量評估，一致性序列不合格的不能用于結果判定。
（四）結果判定
將獲得的DNA序列與標準核酸序列數據庫的標準核酸序列（標準核酸序列的建立參照9109標準核酸序列建立指導原則）進行比對。判定標準為：對于動植物來源供試品，測序結果與標準核酸序列的差異應控制在物種的種內差異水平；對于微生物來源的供試品，測序結果與標準核酸序列的差異應控制在適宜的菌株鑒定水平；對于生物制品生產檢定用菌毒株和動物細胞基質等供試品，其核心序列應與標準核酸序列完全一致或核心序列所編碼的氨基酸序列應與標準核酸序列所編碼的氨基酸序列完全一致。