DNA測序儀的操作步驟

　　pcr測序反應

　　(1) 取0.2ml的pcr管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：

　　所加試劑 測定模板管 標準對照管

　　bigdye mix 1μl 1μl

　　待測的質粒dna 1μl －

　　pgem-3zf (+) 雙鏈dna － 1μl

　　待測dna的正向引物 1μl －

　　m13(-21)引物 － 1μl

　　滅菌去離子水2μl 2μl

　　總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊pcr管，用手指彈管混勻，稍離心。

　　(2) 將pcr管置于9600或2400型pcr儀上進行擴增。98℃變性2min后進行pcr循環，pcr循環參數為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個循環，擴增結束后設置4℃保溫。

　　醋酸鈉/乙醇法純化pcr產物

　　(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml ep管中。

　　(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。

　　(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12 000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。

　　電泳前測序pcr產物的處理

　　(1) 加入12μl的tsr于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解dna沉淀，稍離心。

　　(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml pcr管中，稍離心。

　　(3) 在pcr儀上進行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷，待上機。

　　分析或打印出彩色測序圖譜

　　上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kv預電泳5min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下電泳2h。電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。

　　序列分析

　　儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。

　　處理儀器

　　測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。