DNA探針的標記實驗

發布時間：2019-03-26 14:32 原文鏈接： DNA探針的標記實驗

核酸探針分子雜交是指具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針；根據標記物不同，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。

實驗方法原理	分子雜交是核酸鏈以堿基配對規則的一種結合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對特定核酸序列進行檢測，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測的進行標記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術的關鍵。放射性同位素標記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標記方法。
實驗材料	DNA
試劑、試劑盒	EGFR-PCR產物 washing buffer Detection buffer TE buffe
儀器、耗材	eppendorf管 Tip頭 PCR儀鑷子無粉手套量加樣器
實驗步驟	1. 滅菌去離子水稀釋1 ug DNA至總體積16 ul。 2. DNA熱變性：DNA樣品于PCR儀中100℃變性10 min，后迅速置于碎冰中3 min 以上。 3. 加4 ul DIG-Random Labeling Mix，混勻后離心2000 rpm×5 min（4℃）。 4. PCR儀37℃反應過夜。 5. 加2 ul EDTA終止反應，標記結束。標記物-20℃保存>1年收起
注意事項	1. 用于標記的DNA模板盡可能純化，以提高標記效率 2. 模板DNA>100 bp。 3. 經DIG標記的探針不能用酚/氯仿抽提純化 4. 根據說明書確定標記效率（標記探針及試劑盒陽性對照DIG標記DNA梯度稀釋，尼龍膜點樣，樣本變性，封閉，雜交，現色定量）。 5. 本法亦可用于單鏈DNA或RNA探針的標記，當標記RNA探針時，需采用逆轉錄酶，收獲產物為標記的單鏈cDNA。 6. 可根據下表標記產物。

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