注意：操作戴手套。
凝膠處理
1)凝膠照相后切去包括標記帶在內的多余部分。將凝膠的一角(·點第一個樣品的一側)切去作為標記 以便于定位。精確測量凝膠大小然后將凝膠放入一個方形瓷盤中 。
2)變性:將凝膠浸泡于適量的堿變性液中,室溫下變性30分鐘。期間更換變性液一次,不斷地輕輕搖動。如果先進行酸變性酸變性,則凝膠中溴酚蘭的顏色由黃變藍對于較大的DNA片段(·如大于15kb)凝膠可在堿變性前用0.25mol/L HCl預處理10分鐘使DNA片段脫嘌呤。凝膠中溴酚蘭的顏色由黃變藍后再進行堿變性。
3)中和:移去瓷盤中的堿變性溶液,用雙蒸餾水漂洗凝膠兩次,然后浸泡于適量的中和液中,室溫下輕輕搖動15分鐘,更換新鮮中和液,再中和15分鐘。
膜處理
1)剪下一張與凝膠面積相同的硝酸纖維素膜(NCP)或尼龍膜,NL,。注意NCP也要剪去一角且不可用手觸摸,粘有油膩的膜不能被濕潤,也不能結合DNA。同時剪8,10張與NCP等大的干凈濾紙
2)將NCP與3,4張濾紙依次漂浮于盛有雙蒸餾水的帶蓋方盤中,使水自然從NCP的下面向上浸潤,待其完全浸濕后,連同浸濕的濾紙一起浸入于轉移液中浸泡5,10分鐘。· 注意,在蒸餾水中如NCP表面有氣泡時,可將其放在65水浴中浸泡幾分中,仍有氣泡或不能完全被濕潤(膜上有白色或黃色斑塊)則不能用于轉移。
轉移
1)取一個較大的方形瓷盤,放一塊玻璃板于盤上,盤內加轉移液(6×SSC或10×SSC)使液面距離玻璃底面約1,2cm,玻璃板表面蓋兩張預先用轉移液浸潤的Whatman 3M ·濾紙(也可用新華濾紙),濾紙兩端浸入SSC轉移液中,用一玻璃棒將濾紙壓平,濾紙與玻璃板間不得有氣泡,
2)將瓊脂糖凝膠翻轉(樣品孔朝下)后置于上述鋪有Whatman 3M·濾紙的平臺上,注意:兩者之間不能有氣泡。
3)用parafilm 蠟膜將凝膠四周平臺上裸露的濾紙封嚴,防止在轉移過程中因短路(轉移液直接從盤中流向吸水紙而不經過凝膠)使轉移效率降低,甚至轉移失敗 ,
4)將處理好的NCP(已切去一角)小心地覆蓋在凝膠上(濾膜的光澤面即標有N.C字樣的一面朝向凝膠),NCP的一端與凝膠的上樣孔對齊,切去的一角與凝膠切角的位置對齊。 注意,濾膜與凝膠之間不能有氣泡,且NCP一旦與凝膠接觸即不可再移動,因為從接觸的一刻起,DNA已開始轉移,
5)將預先用轉移液浸潤過的與NCP大小相同的Whatman 3M濾紙覆蓋在硝酸纖維素膜上,排出濾紙與膜之間的氣泡,
6)再放幾張相同大小的干濾紙和一疊厚約10,15cm的吸水紙于濾紙上,頂部壓一塊玻璃板和1kg左右的重物。
7)靜置12,15小時使其充分轉移,其間換吸水紙1,2次。轉移液在吸水紙的虹吸作用下從盤中轉移到吸水紙上,從而帶動DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到NCP上,
8)轉移結束,移去吸水紙和濾紙,在NCP上用鉛筆標上點樣孔的位置。·將NCP浸泡在2×SSC中5分鐘以去除瓊脂糖碎塊。將膜放置于一張干燥的新鮮濾紙上,
9)在紫外燈下觀察凝膠和NCP膜,以了解DNA轉移的情況。·在紫外燈下凝膠不顯示熒光,NCP膜呈桔紅色,并可見到條狀的DNA帶。
10)把NCP置于兩層干燥新鮮的濾紙間,真空下80℃烘烤2小時(亦可用其它方法)。此過程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。
11)此NCP既可直接用于雜交,亦可用塑料薄膜密封,置,20℃冰箱保存備用。
注意事項
1,操作時戴手套,嚴禁用手接觸凝膠和硝酸纖維素膜,
2,轉移時,濾紙與膜、膜與凝膠、凝膠與濾紙橋之間均不能有氣泡,否則影響DNA轉移,
3,凝膠易碎,操作時應格外小心,
4,硝酸纖維素膜上的DNA固定非常重要,固定不好時DNA·在雜交過程中會脫落下來,烤膜溫度過高,膜脆性增加,易碎,
5,大片段DNA轉移效率低,可在堿變性前用0.25mol/L HCl浸泡凝膠10,15分鐘,使DNA分子脫嘌呤或用短波(260mm)紫外光照射10,20分鐘后再行堿變性、轉移以提高大片段DNA的轉移效率。
6,轉移液中鹽離子濃度對轉移有較大影響。10×SSC條件適中,能有效地轉移 1,20kb的DNA片段,速度也比20×SSC快,比較常用,6×SSC轉移速度最快,·對于高分子量DNA片段(>10kb)的轉移較理想,但小分子DNA易丟失。若轉移DNA片段較小 ,則宜選用20×SSC。因此應根據不同目的選擇適當的轉移液。