| 實驗步驟 |
材料
緩沖液與溶液
貯存液、緩沖液與試劑的成分見附錄 1。
稀釋貯存液至所需濃度。
二磷酸氯喹（100 mmol/L)
溶解 60 mg 二磷酸氯喹于 lml 去離子水中。用 0.22um 濾紙過濾溶液。濾液存于箔紙包裹的試管內，-20°C 保存。
見信息欄中二磷酸氯喹
DEAE-葡聚糖（50 mg/ml)
溶解 100 mgDEAE-葡聚糖（相對分子質量=500000;Pharmacia 公司）于 2 ml 去離子水中。溶液于 15pai(1.05 kg/cm2) 液體循環高壓滅菌 20 min。高壓也有助于聚合物的溶解。
最初用于轉染的 DEAE-葡聚糖分子質量大于 2x106(McCutchan and Pagano1968)。這種 DEAE-葡聚糖現在已經買不到了，但某些實驗室會偶有存貨。這種老批次的高分子質量 DEAE-葡聚耱的轉染效率髙于現在常用的低分子質量聚合物。
磷酸鹽緩沖液（PBS)
使用前過濾除菌，室溫保存。
含葡萄糖的 Tris-緩沖鹽溶液（TBS-D)
使用前于 TBS 溶液中加入 20%(m/V) 葡萄糖（用水制備，高壓滅菌或過濾除菌)。蔔萄糖終濃度應為 0.1%(V/V)。
核酸與寡核苷酸
質粒 DNA
為得到最高轉染效率，應用層析柱（見第 1 章方案 9) 或 CsCl?溴化乙錠密度梯度離心（見第 1 章方案 10) 純化質粒 DNA。
培養基
細胞生長培養基（完全培養基與無血清培養基）
特殊設備
組織培養皿（60 mm 或 35 mm)
此方法適用于用 60 mm 或 35 mm 堉養皿培養細胞。如果使用其他多孔板、細胞瓶或其他宜徑的培養皿，按比例改變細胞濃度與試劑的用量。見表 16-3。
附加試劑
本方案第 8 步所需試劑列于第 6 章方案 1 與第 7 章方案 8。
細胞與組織
指數生長的哺乳動物細胞
方法
1. 轉染 24 h 前，通過胰酶消化收獲指數生長的細胞并以 105 細胞/培養皿（或 5x104 細胞/35 mm 培養皿）的密度轉移至 60 mm 培養皿中。加 5 ml(35 mm 培養皿 3 ml) 完全培養基，于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱內培養細胞 20~24 h。
轉染時細胞應 75% 長滿。如果轉染前細胞生長少于 12 h, 細胞不易貼壁，加入 DEAE 葡聚糖后容易脫壁。
2. 將 0.1~4ug 超螺旋或環狀 DNA 與 1 mg/mlTBS-D 溶解的 DEAE-葡聚糖混合制備 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。
每 60 mm 培養皿需 0.25 ml 溶液; 每 35 mm 培養皿需 0.15 ml 溶液。
要獲得髙水平瞬時表達所需
DNA 的量取決于構建體的性質，應在預實驗中摸索合適的用量。如果構建體攜帶在轉染細胞內能發揮作用的復制子（如，SV40
早期區域啟動子/復制起點），每 105 細胞用 100~200ngDNA 即可；如果無復制子，則需要的 DNA 要多一些（每 105 細胞
1ugDNA)。
3. 吸去培養基，用預熱（37°C) 的 PBS 洗滌細胞兩次，用預熱的 TBS-D 洗滌細胞一次。
4.
加入 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液（每 60 mm 培養皿 250 每 35 mm 培養皿
150ul)。輕輕振動培養皿使溶液均勻覆蓋于細胞層上。將培養皿放回孵箱培養 30~90 min(培養的時間取決于各批細胞對
DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液的敏感度）。每隔 15~20 min,
從孵箱中取出培養皿，輕輕搖動，在顯微鏡下檢査細胞形態。如果細胞仍然貼壁，則繼續培養。當細胞開始萎縮并變圓時停止培養。
5. 吸去 DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液。用預熱的 TBS-D 洗滌細胞一次，再用預熱 (37°C) 的 PBS 洗滌細胞一次，注意不要吸走轉染的細胞。
6. 加 5 ml(每 60 mm 培養皿) 或 3 ml(每 35 mm 培養皿）預熱的含血淸與氯喹（終濃度 100umol/L) 的培養基，在 CO2 濃度為 5%~7% 的 37°C 孵箱內培養 3~5 h。
用氯喹處理細胞后轉染效率會增加敗倍，可能是因為氯喹抑制溶酶體水解酶降解
DNA(Lutbman and Magnusson1983),
但應注意，DEAE-葡聚糖與氯喹的混合物會產生嚴重的細胞毒效果。因此應在預實驗中確定
DEAE-葡聚糖處理后的細胞接觸氯喹的最長時間（詳情見信息欄中二磷酸氯喹）。
7. 吸去培養基，用無血清培養基洗滌細胞 3 次。加入 5 ml(每 60 mm 培養皿）或 3 ml(每 35 mm 培養皿）預熱的含血清培養基，在 CO2 濃度為 5%~7% 的 37°C 解箱內培養 36~60 h, 然后檢測轉染 DNA 的瞬時表達。
應優化特定細胞系與構建體的孵育時間。
8. 要檢測轉染細胞對導入 DNA 的瞬時表達，于轉染后 36~60 h 收獲細胞。通過雜交分析 RNA 或 DNA。通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印潰、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。
為減小不同培養皿之間轉染效率的差異，最好 (1) 用每一構建體轉染數個培養皿；(2) 孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；(3) 將細胞匯集起來；以及 (4) 重鋪細胞于數個培養皿上。
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