CESI8000QExactive電泳質譜聯用快速表征生物制品

　　在生物制藥行業，由于單克隆抗體藥物（mAbs）的雜質和異質性可以影響安全性或療效，對其進行全面和可重復性的表征至關重要。單克隆抗體是一類高分子量的糖蛋白（約150 kDa），同時包含一些其他的翻譯后修飾（PTMs）。單克隆抗體肽譜（第三水平表征）可以提供關于純度和異質性的定性和定量的信息。毛細管電泳結合質譜具有優越的分離效率和對于單克隆抗體肽段和糖肽的表征能力。運用電噴霧（ESI）作為電離源，將CE和ESI整合在一個動態的過中（CESI技術），可對多肽和單抗進行高效的分析。

　　本文中，我們將展示使用CESI 8000（AB Sciex Separation）結合Q-Exactive質譜（Thermo）系統的對曲妥珠單抗的第三水平的表征數據。該分析是將CE與ESI整合在一個動態的過程中，與高分辨質譜結合使用，結果顯示該聯用有如下優勢。不同大小的肽段（3-65氨基酸）都可以被定性、分離和定量。特別是，我們可以對僅僅100 fmol（15 ng）的樣品進行降解熱點的定性定量分析，如天冬酰胺脫酰胺化、蛋氨酸氧化、谷氨酸環化和C末端賴氨酸的異質性。通過對糖肽的分離、定性和定量可以全面表征Asn300的糖基化熱點。總體來說，這些結果表明使用CESI技術結合高分辨率的質譜可以僅需很少的進樣量并只使用單一蛋白酶——胰蛋白酶，通過對肽段及糖肽譜圖分析，就具有對單抗快速全面表征的能力。

　　CESI技術對于質譜分析的優勢

　　? 低流速，CESI技術使用的流速大約在20 nL/min，能最大化離子化效率，且大大降低離子抑制效應，從而保證修飾肽段和糖肽更好的離子化。CESI技術使用的是一根開管的毛細管，因而無需其它的毛細管和泵連接流控裝置。

　　? 高效的分離，毛細管電泳的固有高分離效率以及尖銳的峰型可保證高靈敏度和可重復性的定性定量分析。

　　? 低樣品用量，CESI技術需要極少的進樣體積（<250 nL）和樣品量（<25 ng）。

　　? 樣品殘留，使用開管模式且沒有任何固體填充，所有樣品（包括親水性和疏水性）都會從毛細管中流出，可以覆蓋到單抗的全部序列并且沒有任何樣品損失和樣品殘留。

　　? 全面，CESI技術在單次運行中使用單一的蛋白酶——胰蛋白酶，可實現100%蛋白序列覆蓋率并可同時完成單抗純度、穩定性和糖基異質性的定性定量分析。

　　? 重現性，在三針重復進樣，每針45分鐘的分離中，遷移時間相差小于30秒（<1.5% RSD），修飾和未修飾的肽段相對含量測定變化小于2%。

　　? 正交，CESI技術使用和LC-MS方法正交的分離機制分離、鑒定、定量和驗證序列變異以及得到翻譯后修飾信息。

　　實驗設計樣品制備：從10 mg/mL 樣品溶液中取出100 μg 樣品，用Rapigest稀釋變性，使用DTT還原和IAM烷基化，樣品在37 ℃經過胰蛋白酶酶解過夜，干燥，用前導電解質溶液（200 mM醋酸銨，pH=4）稀釋三倍，得到最終濃度為300 ng/μL的抗體酶解產物。

　　CESI-MS/MS：AB Sciex 的CESI 8000連接 Thermo的Q-Exactive質譜儀。

　　向熔融石英毛細管中進樣50 nL溶于約100 mM前導電解質中的樣品（相當于100 fmol或15 ng的單抗酶解產物），并在瞬時等速電泳下進行分離前的濃縮。以10%的醋酸作為背景電解質，進口端緩沖瓶和CESI噴口間的分離電壓為20 kV。樣品重復進樣三次進行分析。

　　質譜的數據采集采用的是數據相關采集（DDA）方式，一級質譜的分辨率為70K，二級質譜的分辨率為17.5K。DDA的參數如下：

　　一級質譜最大采集時間為120 msec，掃描范圍為150-1800 m/z，二級質譜掃描強度大于3.3×104的前10種離子，最大采集時間為60 msec。HCD裂解使用27%的碰撞能量。質譜掃描周期小于/等于1秒。為匹配CESI的尖峰（約30s寬），動態排除時間設為15秒。

　　數據分析：數據分析運用AB SCIEX ProteinPilot?（肽段和修飾后肽段鑒定），ProteinMetrics Byonic（糖肽鑒定）和Thermo Xcalibur（肽段定量）。通過ProteoWizard MS將Thermo的.RAW文件轉換成.MGF文件。使用曲妥珠單抗、常見雜質、以及蛋白的逆序數據庫檢索。手動提取糖肽并通過MS/MS圖譜進行糖類離子的確認。

　　CESI技術過程

　　使用瞬時等速電泳-毛細管區帶電泳來分離蛋白藥物的酶解產物。在區帶電泳中，肽段根據它們的電荷/阻力系數，（即電荷/質量比）進行分離。因此根據肽段與其PTM產物的電荷或質量不同而得以分離。在毛細管區帶電泳中，向毛細管入口端通過壓力進樣約10%毛細管體積的樣品，使樣品在瞬時等速電泳（t-ITP）過程中根據在電場中的遷移率和梯度區域進行聚集。由于進樣量提高了10倍，使用t-ITP可將常規CZE方法的靈敏度提高十倍，而并不會損失CZE的高分離效率。

　　電滲流是在電場中由毛細管內壁產生的電荷引起的。即使在pH為4的10%醋酸緩沖液中，也能使毛細管內壁的硅羥基保持大量負電荷，用以驅動電滲流到毛細管出口。與壓力驅動產生的拋物線流型不同，電滲流產生的是塞面流型，可以減少樣品帶變寬而獲得尖銳的峰型。電滲流以20 nL/min的速度驅動所有被分離的肽段到達電離源，之后被電離。在這個速度下，納噴源的優勢得以充分體現。

　　電噴霧離子化的電壓施加在CESI的噴口，以10%的醋酸作為電導液。去除毛細管噴口的聚酰亞胺涂層并且通過化學腐蝕使小離子可以通過毛細管壁，形成毛細管電泳的電流回路。ESI源的作用是使肽段從液態形式轉化成氣態形式。只有CESI中的流出物進入ESI源，而無任何鞘液的稀釋，保證了超低流速nL/min帶來超高的靈敏度。

　　CESI-MS技術肽段的分析

　　胰蛋白酶酶解肽段具有較大的質量范圍和電離狀態，適合用CE進行分離。使用CESI技術，曲妥珠單抗酶解的肽段在25-38分鐘內得以分離（如圖1）。在42分鐘后，還可以鑒定出基峰的電泳圖(BPE)中沒有看到肽段，如糖肽。后續將進行詳細講解。三針的重復性實驗中，譜圖的定性比較（圖1A）和遷移時間（表1）均獲得很好的重現性。通常情況下，肽段在質譜中的m/z和CE中的電荷/質量比會存在一定的相關性（圖2B）。然而在整個遷移窗口范圍內對不同質/荷比的肽段的分離有助于對其進行全面的定性和定量。圖1C中一些代表性肽段的分離峰表明了過大和過小的肽段可同時被分離。此外，從這些提取的肽段中可以發現CE分離得到的峰型十分尖銳（15-50秒寬），有利于肽段的定性和定量。

圖1. CESI技術對肽段分離。（A）曲妥珠單抗胰蛋白酶酶解產物的三次CESI-MS技術（Thermo QE）分析電泳圖。（B）肽圖。（C）單次CESI -MS技術運行中具有代表性的大小肽段的提取離子電泳圖。

　　100%的序列覆蓋度

　　在自下而上（bottom-up）的蛋白質組學研究中，有許多因素可以有助于實現100%的蛋白序列覆蓋。除了已經闡述過的肽段可以被CESI-MS技術更有效地分離及離子化，蛋白質數據庫搜索也是一個很重要的步驟。ProteinPilot?的Paragon計算方法可以快速、方便地對蛋白及超過300種PTMs進行定性，使其成為蛋白酶解產物全面表征的重要工具。如圖2顯示了在三次重復運行中，數據庫搜索結果均獲得了重鏈和輕鏈的100%序列覆蓋度。胰蛋白酶酶解產物的混合物中很小或很大、親水或疏水的肽段都可以得以分離，使輕鏈和重鏈實現100%序列覆蓋度。

圖2. 經CESI 8000 – Q-Exactive MS系統分離檢測，Protein Pilot?數據庫搜索而獲得的曲妥珠單抗重鏈和輕鏈的100%的序列覆蓋率。

　　上圖顯示了100%的覆蓋率的重鏈和輕鏈。中圖顯示重鏈和輕鏈這兩組蛋白中用于蛋白指認的代表性肽段。下圖顯示了鑒定的序列覆蓋率，編碼顏色反映了鑒定自信度。在輕鏈中，幾乎100%的肽段序列覆蓋自信度超過95%（綠色）。兩個低自信度的短肽段（黃色）使用手動檢索進一步確認。三次重復性CESI-MS技術分析均達到了100%序列的覆蓋度。

　　肽譜第三水平的表征

　　CESI-MS技術得到的肽譜與LC-MS相似，通過串聯質譜（MS/MS）和提取肽段電泳峰識別肽段序列。提取的離子電泳（XIEs）可用于不同的生物藥的序列和PTM豐度的比較，如不同的單抗批次或是原研藥、生物類似藥和生物優勝藥的比較。

　　表1. 曲妥珠單抗降解/翻譯后修飾熱點的鑒定和相對定量。

　　圖3. 曲妥珠單抗中降解熱點的肽譜。MS/MS 鑒定修飾前后的肽段（A）N-端谷氨酸環化（焦谷氨酸），（B）蛋氨酸氧化（MetOx），（C）C-端賴氨酸的異質性，（D）天冬酰胺脫酰胺化，（E）色氨酸氧化，（F）賴氨酸糖基化。提取離子電泳圖的坐標軸按低豐度肽段的峰高調整。氨基酸位點和PTM種類信息已標注在相應的圖中。

　　圖1A和1C中基峰圖和提取離子圖顯示出CE特有的尖銳的峰型可用于肽譜的比較。CESI技術超高的分離能力結合MS在質量維度上的高分辨率可很容易的比較兩個或以上的樣品的提取離子峰圖。對曲妥珠單抗中肽段降解熱點成功的定性和定量表征（圖3和表1），可充分地說明CESI-MS技術對于肽譜分析的能力。常見的降解PTMs有N-端谷氨酸環化，蛋氨酸氧化，C-端賴氨酸異質性，天冬酰胺脫酰胺化，色氨酸脫氧化和賴氨酸糖基化。除此之外，還有一些ProteinPilot?可鑒定出、但在這里沒有列出的其它一些豐度略小的PTMs降解位點。

　　通過高度匹配的高分辨MS/MS碎片譜圖(圖3)和微小的母離子質量誤差（表1）可對這些降解PTMs進行明確的鑒定。對于質量偏移較大的修飾（如氧化，+16 Da；脫水，-18 Da； 糖基化，+162 Da；和C端賴氨酸缺失，-128 Da），匹配的質譜圖可以提供明確的依據。對于質量變化較小的肽段，如天冬酰胺脫酰胺化，僅僅只有一個道爾頓的質量區別，CESI技術可提供進一步的鑒定信息。對于測量相差一個道爾頓的兩個峰，最大的挑戰在于即使使用高分辨的MS，未修飾和脫酰胺肽段的同位素分布還是會互相重疊。此外，反相色譜往往不能分離沒有疏水性變化的物質，如天冬酰胺（Asn）轉變為天冬氨酸（Asp）。然而，Asn（中性）和Asp（酸性）之間一個電荷的差異能很好地被CE分離。因此，這兩個肽段可通過CE在空間上得到分離（圖3D），從而證明它們MS上較小的質量差異是來自兩個不同的肽段，而不是同一個未修飾肽段中的同位素峰（13C）。此外，中性的天冬酰胺和帶負電的天冬氨酸會有不同的向陽極遷移時間改變（大約30秒）。也就是說，陽極對于帶負電荷較多的肽段有更強的吸引力。

　　對其它在MS中有更明顯質量數變化的PTMs，毛細管電泳也可體現出分離的優勢。例如，兩性的N-端谷氨酸（在CESI-MS技術的酸性條件下帶正電荷）轉變為中性的焦谷氨酸，電荷的差異導致降解PTM后遷移時間有明顯的改變（圖3A）。另外，谷氨酸相對于焦谷氨酸向陽極遷移的改變，也和脫酰胺化相同。同樣，重鏈上C -端賴氨酸的異質性源于帶正電荷的賴氨酸丟失，也有一個很大向陽極的遷移時間改變（圖3C）。更重要的是，所有修飾的肽段都具有很高的遷移時間重現性，其標準偏差小于30秒。因此，這些遷移時間的變化適用于肽圖的定性分析。當然，這樣的分離能力也適用于PTM的相對定量。同樣，CESI技術分離不僅可對脫酰胺化修飾進行高自信度的鑒定，還提高了對脫酰胺化肽段定量的能力。肽段的定量是基于提取離子峰在時間軸上的量來實現的。由于未修飾和脫酰胺的肽段在CESI技術過程中可空間分離，其同位素分布不會重疊，因而它們的提取離子峰在時間軸上也不會重疊。

　　在圖3D中我們可以觀察到分別代表未修飾和脫酰胺的肽段的兩個提取離子峰可完全被分離。然而，對于即使CE也不能分離的肽段，毛細管電泳也可以有超越LC技術的相對定量優勢，因為CESI技術的低流速可消除離子抑制作用。因此，無法分離的修飾后和未修飾的肽段峰可以更好地代表其真實的相對含量。在曲妥珠單抗降解PTMs的表征中，這個優勢可以應用于蛋氨酸氧化、色氨酸氧化和賴氨酸糖基化的相對定量。

　　表1展示的是降解PTMs的相對含量。值得注意的是，在三針CESI-MS技術的運行中，相對豐度變化一般小于0.2%。然而，對于那些在樣品制備中也可能發生的修飾（如蛋氨酸氧化和天冬酰胺脫酰胺化），它們三針重復的相對豐度變化小于3%。對這些降解PTMs的相對定量很直接、簡單，將修飾肽段的峰面積除以它和未修飾肽段峰面積之和即可。賴氨酸糖基化的相對定量要復雜一些。胰蛋白酶不能切割糖基化的賴氨酸，但是可以切割非糖基化的賴氨酸。因此，需要用到不同的肽段序列對它們進行相對定量。選擇糖基化賴氨酸肽段中豐度最高的片段用于相對含量的計算。然而，用肽圖來進行賴氨酸糖基化的表征會更加直觀，因為不用考慮胰蛋白酶裂解的差異。

　　糖肽圖譜第三水平的表征

　　治療性單抗的糖型通常是在第一和第二水平通過MS檢測完整和還原蛋白的分子質量、以及在第四水平通過對裂解寡糖的LC或CE分離進行表征的。N-糖基化通常連接在IgG1的Fc區保守序列的天冬酰胺殘基上，然而也有可能連接在可變區域、非保守區域、甚至谷氨酰胺位點。因此，特異性的糖基位點定位成為mAb表征的重要步驟。然而，第一、二、四水平的表征還無法很好的確認N-糖基化的位點。即使是在第三水平使用LC-MS鑒定，由于RPLC無法對糖肽進行分離，也可能對糖基結構產生誤判以及對相對豐度的測定存在偏差。而CESI-MS技術則可通過對糖肽的高效分離和電噴霧離子化在第三水平表征中得到全面的糖型分析結果。

　　圖4A和B顯示的是糖肽分離的實驗，表2是它們的平均遷移時間。糖肽的遷移時間具有很好的重現性，并且在三針重復運行中，其遷移時間相差大概在30秒左右。正如前面提到的，毛細管電泳的分離是基于肽段的電荷/阻力比。糖基中的每一個糖單元都可為相應的糖基在CESI技術分離中增加相應的阻力，這就是CESI-MS技術可將糖肽分離和表征的關鍵。含有高甘露糖的糖肽：M5（也稱為Man5）、非巖藻糖基化的雙天線復合物：A2、A2G1和A2G2（也稱為G0、G1和G2）、巖藻糖基化的雙天線復合物：FA2，FA2G1和FA2G2（也被稱為G0F、G1F和G2F）和一些不帶電荷的糖基都可通過這個機制進行分離。對于巖藻糖基化（圖4A）和非巖藻糖基化（圖4B）系列的糖型，從電泳峰可以看到基線分離。此外，盡管不太明顯但從圖4可以看出，相同糖基結構的非巖藻糖基化和巖藻糖基化的糖型也有不同的遷移時間。例如，A2和FA2（也可稱為G0和G0F）的平均遷移時間不同，分別為35.00和34.72分鐘（表2）。又如，A1，FA1和FA2糖型（也可稱為G0-GlcNAc，G0F-GlcNAc和G0F）與5-N-乙酰神經氨糖酸（Neu5Ac），由于糖肽的電荷發生變化導致了遷移時間的較大改變。這個機制與降解PTMs遷移時間改變的機制相似，修飾后的糖肽比未修飾的糖肽更偏酸性（圖3A、C和D）。

　　與其它修飾后的肽段一樣，糖肽的提取離子電泳圖依賴通過對母離子及其碎片離子的精確質量數的測量對它們進行定性。糖肽鑒定同樣也具有非常高的質量精度（表2），均低于±5 ppm誤差。我們以相對豐度最低的A2G2S1和最高的FA2G1的圖譜來說明MS/MS用于糖肽定性的性能（圖4B）。與大多數已鑒定的糖肽質譜圖一樣，其中有一些和肽段序列吻合的b-和y-型離子，然而譜圖匹配主要來源于糖的特征峰：完整糖肽的分子量的測定，糖肽上糖單位的多級丟失，以及多級碎片離子。即使豐度最低的糖肽都有高響應高質量匹配度的圖譜，說明對其他更高豐度的糖肽具有更高的鑒定能力。表2是曲妥珠單抗鑒定出的糖型相對定量值。最值得注意的是，鑒定出A2G2S1糖型的相對豐度僅為0.06%。從相對豐度最高的FA2G1（54.49%）到A2G2S1（0.06%），其定量范圍跨越3個數量級。在這1000倍的動態范圍內，鑒定并定量出20種糖型的糖肽。而且大部分糖肽的相對豐度數值具有較好的重現性，其變異系數均小于10%。因此，CESI技術和MS技術聯用可高效分離并高靈敏度的鑒定糖肽，從而對mAb的糖基化進行可靠的鑒定和定量。

　　圖4. 經CESI-MS鑒定的糖肽的提取離子電泳圖。經MS/MS鑒定，提取的離子峰用于相對定量。（A）巖藻糖基化糖型和（B）非巖藻糖基化糖型。圖中以豐度最低的糖型A2G2S1為代表，展示了其糖肽的MS/MS圖。圖中綠色標注的是糖基碎片離子。詳細的糖肽表征結果見表2。

　　表2. 曲妥珠單抗重鏈N300位點上糖基化的鑒定和相對定量。

【結論】

本文展示了利用CESI-MS技術平臺，即穩定高效的分離和納噴霧離子化技術CESI技術，與高準確度、高分辨率的質譜技術的在線結合，對治療性單抗藥物進行定性和定量分析。在CESI技術的設計中，毛細管出口端本身也是電噴霧的噴針，使得肽段被分離后直接經電噴霧離子化進入質譜。CESI技術的納噴源中產生的液滴非常小，因此可獲得最高的離子化效率。20 nL/min的超低流速，極大的降低了離子抑制效應，為相同樣品中的低豐度糖肽提供了高靈敏度的分析的可行性。對豐度低至0.06%的糖肽的相對定量展示了方法的高靈敏度。對豐度跨越三個數量級的20個糖肽的糖型鑒定和定量展示了方法寬泛的動態范圍。此外，CESI-MS技術還可實現對單抗藥物中相對豐度低至0.3%的降解PTM熱點，如蛋氨酸氧化、天冬酰胺脫酰胺化、N-端谷氨酸環化成焦谷氨酸、重鏈C-端賴氨酸的異質性、色氨酸氧化和賴氨酸糖基化的分析。對曲妥珠單抗的上述分析結果，充分的展示了CESI-MS技術是生物制品表征中一項具有眾多優勢的技術。它將成為對于一級序列和糖譜的快速、全面、高重現性分析的重要手段。