全血中含有有核白細胞，因此從血液中抽提 RNA 比較方便，但是紅細胞富含核糖核酸酶，所以從血液中分離 RNA 奮其持殊的難度。因此若能先將有核白細胞與紅細胞分離開來，從血液中抽提 RNA 更易成功。下述方法是酸-酚. 胍法?硫氰酸胍吋裂解細胞，并有效地滅活核糖核酸酶。
| 試劑、試劑盒 | 磷酸鹽緩沖液淋巴細胞分離液RNAzol B( BiogencsisUK）氯仿異丙醇乙醇氯化鈉DFPC 處理的水離心管1.5X 溶 液 D: 6 mol L 硫氰酸胍檸檬酸鈉十二烷基肌氨酸鈉2-巰基乙醇酚乙酸鈉 |
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| 儀器、耗材 | 離心管 |
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| 實驗步驟 | 一 材料與設備
1. 鮮血中 RNA 提取
1)磷酸鹽緩沖液 (PBS)
2)淋巴細胞分離液
3)RNAzolB (Biogencsis,UK）
4)氯仿
5)異丙醇
7)乙醇
8)5mol/L 氯化鈉
9）DFPC 處理的水
10）10 ml 離心管
2. 冰凍血液中 RNA 提取
1)1.5X 溶液 D:6mol/L 硫氰酸胍，37.5 mmol/L 檸檬酸鈉 pH7.0,0.75% 十二烷基肌氨酸鈉 H0.15mol/L2-巰基乙醇
2) 酚：氯仿（5:I，pH 約 4.0)
3)4,2mol/L 乙酸鈉 pH4-0.
4) 異丙醇。
5) 乙醇。
6)30 ml 離心管
二 操作方法
1. 鮮血中 RNA 提取
1) 在 20 ml 無菌管中. 用磷酸鹽緩沖液稀釋抗凝全血 (2:l)10 mL
2) 小心將 10 ml 稀釋的血液加人離心管中，管中含有 3m] 淋巴細胞分離液。確保血液和分離液冇十分明顯的界面. 二者間應極少或沒有混合。
3）室溫下 400 g 離心 30?40 min，或 800 g 離心 15 min
4) 離心后獲得澄清的溶液，聚集的紅細胞沉到管底，單核細胞包括淋巴細胞形成明顯的云樣帶位于上層血漿相和下層淋巴細胞分離液的界面。用吸頭將單核細胞層移至另一離心管中。
5) 加入 1XPBS 至混合均句，如步驟 3 離心。
6) 去掉上層溶液. 在該狀態下，淋巴細胞可在-20℃ 儲存幾天。
7) 加人 0.RMAzolB 裂解細胞，反復用吸頭吹打，以充分吹打以溶解細胞。
8) 移人另一無菌 Eppendorf 管中，加入 50u1 氯仿，劇烈振蕩 15s，4℃ 或冰上孵育 5 min，樣本可在該狀態保持 1?2 h
9)12000 g 離心 15 min
10) 將上層水相移至一個新的 Eppendorf 管，小心避免與中間相混合，該中間相含 DNA 和蛋白質。加人等體枳異丙醇約 400ul,4℃ 或 20℃ 過夜。
11)12000 g 高速離心 15mim，管底可見:RNA 沉淀。
12) 移去上清液，加入 800ul75% 乙醉冼滌 RMA 沉淀一次，7500 g 離心 8 min。
13) 加人 200ul0.2mol/L 氯化鈉再溶解 RNA。用 400ul100% 乙醇沉淀 RNA，一 20℃ 放置 lh
14)12000 g 高速離心 15 mm,RNA 沉淀用乙醇洗滌同上
15) 打開管 L1，室溫干燥 15 min
16) 加人 50?100ulDEPC 處理的水，溶解 RNA, 為增加溶解度，可在 52?60℃ 助溶 5?I5 min
17) 定量分析 RNA
2. 冰凍血液中 R1NA 提取
1) 水浴加熱 2 ml(或 5 ml) 的冰凍全血
2) 標本充分融化后，將其移人無菌的 30 ml 離心管中，內含 3 ml(或 5 ml)1.5XD 溶液，混合均勻。加人 6 ml(或 1Oml) 酚：氯仿（5:1) 和 0.5 ml（或 1 ml)4.2mol/L 乙酸鈉，PH4.0, 混合均勻，混合時最好用封口膜封口。
3) 冰上孵育 20mim。
4)5500 g，4℃ 離心 30 min
5）轉移上清液至另一離心管中
6) 加人等體積的異內醇，一 20℃ 過夜。
7)5500 g 離心 30 min
8) 棄上清液，將管倒置 2?3 min
9) 加入 300ul1.5X 溶液 D 溶解沉淀。如需要再加入 400ul 異丙醇,—20℃ 放置 lh
10) 室溫下 11000 g 離心 lOmin
11) 棄上清液，加人 750ul75% 乙醇洗滌沉淀，11000 g 離心 2 min
12) 棄上清液，加人 50ulDEPC 處理水溶解 RNA
13) 定量分析 RNA 收起 |
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| 注意事項 | 1)RNAzolB 含有硫氰酸胍，該物質有刺激性，因此建議在通風櫥中處理硫氰酸胍。
2) 合適的抗凝劑是 3.8% 檸檬酸鈉，1:10 稀釋人全血。肝素可能干擾反轉錄和 PCR。
3) 中間相可能非常彌散而看不到水相。遇此情況，可將標本放置，直到中間相沉積 (若需要，可以過夜) |
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