1引 言
單個細胞在結構、組成及代謝等方面存在差異，這種差異帶來的影響在組織、器官等的功能上均有所體現。針對多個細胞的常規分析方法測得的結果通常無法保留這些個體差異信息，難以準確評估及預測細胞的生理學行為，因此，單細胞分析引起越來越多的關注[1]。單細胞分析的一個重要內容是單細胞脂質分析。脂質代謝是細胞代謝的一部分，在外界環境刺激下，細胞代謝途徑將發生改變，同時誘導脂質組分發生改變，例如丙肝病毒侵染細胞后，改變了膽固醇代謝，使得細胞內膽固醇代謝物鏈甾醇增多[2， 3]； 人體乳腺組織為了應對微環境的改變，其脂肪酸、磷脂酰肌醇等組成成分增加[]； 用谷物喂養的小鼠其腦部組織中膽固醇含量大大下降[5]。由此可見，脂質與細胞代謝過程密切相關，單細胞脂質分析對于理解細胞代謝過程具有重要意義。
單個細胞具有較小的尺寸（微米級）和極低的分析物量，這就要求單細胞分析手段具有極高的靈敏度及空間分辨率，因此，單細胞分析是一個大的挑戰[6]。單細胞成像是單細胞分析最重要的領域之一，目前用于單細胞成像的技術主要包括光學顯微鏡[7，8] 、電子顯微鏡[9]、掃描探針顯微鏡[10]及質譜成像[11，12]等，這些技術為單細胞分析提供了豐富的結構、形貌及組分空間分布等信息[13，1]。質譜成像是一種非標記的化學成像方法，可以同時對多種成分進行成像分析[15，16]。目前的質譜成像技術主要包括基質輔助激光解吸電離質譜（MALDIoMS）[17]、解吸附電噴霧質譜（DESIMS）[18]及二次離子質譜（SIMS）[19]。MALDIoMS常用于組織成像，然而其空間分辨率仍難以滿足單細胞分析的需求，目前報道的最高橫向分辨率為5 μm[20]。SIMS在質譜成像中具有最高的空間分辨率，其橫向分辨率可達100 nm以下，適用于單細胞成像。飛行時間二次離子質譜（oSIMS）使用飛行時間檢測器，具有較高質量分辨率。目前oSIMS用于單細胞分析已有報道[21～23]，但其對于生物分子較低的離子化產率一直是限制其應用的主要問題之一。為了提高二次離子化產率，主要從新型離子源[2]、激光輔助置后電離[25]以及基質增強[26]等方面展開研究。本研究利用MALDIoMS中常用的基質材料2，5二羥基苯甲酸（DB）和貴金屬基底增強脂質分子在oSIMS檢測中的離子化產率，并進一步優化儀器參數，以期獲得高質量的單細胞成像結果。
2實驗部分
21儀器與試劑
Denton電子束蒸發設備（美國Denton公司）； Petroff細胞計數器（美國ausser公司）； 冷凍干燥機（北京四環公司）； 飛行時間二次離子質譜（oSIMS，德國IONO公司）。
醋酸銨、丙酮、乙醇、2O2及2SO（分析純，上海凌峰化學試劑公司）； 磷脂酰膽堿（PC （0：0）， 美國Avanti Polar Lipids公司）； 人乳腺癌MC7細胞（南京凱基生物公司）； 2，5二羥基苯甲酸（DB）、10% 胎牛血清（SigmaAldrich公司）； 其它試劑均為分析純。實驗用水由MilliQ超純水系統（美國Millipore公司）制備。硅片（1 cm×1 cm， 北京中鏡科儀有限公司）。
22實驗方法
221樣品前處理硅片依次在丙酮、乙醇和水中超聲30 min，用去離子水吹洗后，氮氣吹干，然后用電子束蒸發儀先鍍3 nm鈦，再鍍30 nm金。洗干凈的硅片及鍍金膜的硅片在Piranha洗液（2SO2O2，3∶1， V/V）中清洗30 s除去表面有機物，再用去離子水沖洗，氮氣吹干。磷脂PC （0∶0）加正癸烷溶解， 配制成2 mmol/L的溶液，并用水稀釋至50 μmol/L。
222細胞培養人乳腺癌MC7細胞接種于Piranha洗液清洗后的硅片或金片，并使用RPMI160培養基（美國GIBCO公司）培養，培養基中加入10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，將細胞置于37 ℃，5% CO2環境中培養2 h。細胞密度由細胞計數器測得。
23樣品制備
培養結束后將基片取出，置于150 mmol/L 醋酸銨溶液（p 7）中清洗30 s，以去除細胞表面殘留的鹽，使用Kimwipe無塵紙將金片邊緣的水吸干，在細胞上方滴加10 μL 01 mg/mL DB溶液，立即轉入液氮中進行快速冷凍，然后冷凍干燥。
分別在硅片和鍍金硅片上滴加2 μL上述磷脂PC（0：0）溶液，然后在其中一片鍍金硅片的磷脂溶液中加入05 μL 001 mg/mL DB溶液，待基片上溶液變干。
2oSIMS儀器參數
oSIMS質譜及成像通過使用30 keV Bi+3 LMIG，Bi+3離子束束流05 pA，分析區域為60 μm × 60 μm，橫向分辨率為200 nm，256×256像素，周期時間130 μs，質量范圍為0～1600 u。 25oSIMS
oSIMS數據由oSIMS自帶軟件SurfaceLab 67進行采集及分析，用于質量校正的峰為： C+， C2+3及C3+3。
3結果與討論
31不同基底對oSIMS脂質離子化效率的影響
常規oSIMS通常被認為是“硬電離”技術，易造成解離分子的嚴重碎片化而難以得到完整的分子離子峰[27]。近年來，簇狀一次離子源，例如Bi+n、 Au+n、 C+60、Ar+n和（2O）+n等的引入大大減少了對分子的破壞，提高了分子的離子化效率，使得oSIMS得以較多地應用于生物小分子的研究[28～30]。然而，由于基質效應，處于細胞中的生物分子離子化效率仍然較低，難以滿足細胞代謝的研究需求。為了研究基底材料對脂質分子離子化效率的影響，分別測試了硅片、鍍金硅片及加基質（DB）的鍍金硅片上磷脂PC （0∶0） 的oSIMS質譜圖（圖1）。結果表明，硅片上PC （0∶0） 準分子離子峰（m/z 8668， [M+]+）信號很弱，信噪比低，而在鍍金硅片上準分子離子峰強度增大為硅片上的20倍，信噪比明顯提高，加入基質DB后，分子離子峰信號增大為硅片上的65倍。結果表明，鍍金基底對于磷脂PC （0∶0） 分子的離子化具有明顯的增強作用，在加入基質DB后，其離子化效率得到進一步的提升，這是因為脂質容易獲得氫質子從而正離子化，而2，5二羥基苯甲酸易解離出氫質子，而氫質子供給脂質以及脂質碎片，使得脂質及脂質碎片二次離子產率提高，因此可以提高脂質的信號強度。
32基底及儀器模式對單細胞表面脂質離子化效率的影響
單細胞尺寸雖小，但其組成極為復雜，在單細胞oSIMS檢測中，復雜的化學環境對于細胞成分的離子化效率具有強烈的抑制作用，即所謂“基質效應”[31]。選擇合適的細胞培養基底有助于減輕基質效應，對于oSIMS單細胞成分檢測具有重要作用。另外，oSIMS成像中一個技術問題是難以同時獲得高質量分辨率和高空間分辨率，這是由于在常規oSIMS儀器中難以同時獲得高離子束流和好的離子束聚焦。“延時提取”（DE）模式是一種飛行時間激光解吸附電離質譜技術中的常用模式，近年來也在oSIMS中有所應用，基本原理是使長脈沖一次離子束轟擊樣品表面獲得的二次離子在樣品上方停留一段時間后再進入檢測器，在保證成像質量的基礎上提高質量分辨率[32]。實驗對比了常規“快速成像”（ast imaging，I）模式與DE模式對單個乳腺癌MC7細胞檢測質譜及成像質量的影響。如圖2所示，在硅片基底上，DE模式下細胞表面磷脂PC （3∶1）的準分子離子峰不僅質量分辨率較I模式有較大提高，峰強度也明顯高于I模式。研究表明，DE技術有利于減少樣品表面凹凸不平帶來的影響[22]，使得更多來自于細胞邊緣或凹陷處的信號被檢測到，因此，信號強度相應增強。另外，細胞表面PC （3∶1）在鍍金硅片上的信號較硅片上稍有減弱，但在加入基質DB后，信號明顯增強。除了磷脂酰膽堿PC（3∶1）外，其它脂質信號也被增強，如PC（28∶0）、PC（32∶0）、PC（3∶2）、PE（3∶2）、PE（3∶1）、PE（36∶0）等。由于磷脂酰膽堿在細胞膜中含量較高，相對于其它脂質信號較強，因此本研究中以磷脂酰膽堿PC（3∶1）作為代表物進行分析。與基底上直接滴加待測物不同，細胞復雜的化學環境使得基底及基質的影響大幅減弱，相應的信號放大倍數也大幅減小。對于細胞表面其它成分（如糖類、蛋白質等），由于其離子化方式各不相同，對于可以獲得氫質子從而正離子化的成分可以增強其信號，反之則不能增強。另外，oSIMS具有半定量分析的功能，對于細胞表面磷脂可以采用對多個樣品進行檢測，通過主成分分析可以半定量地比較細胞表面脂質成分的差異性，能夠對因細胞自身狀態而導致脂質組分的不同做出判斷。
33單細胞表面脂質oSIMS成像研究
為研究不同基底及檢測模式對于單細胞脂質成像的影響，測定了在硅片、鍍金硅片及鍍金硅片加基質情況下磷脂PC頭基（m/z 1810）的成像圖，如圖3所示，并研究了I及DE模式對于成像的影響。對比圖3A和3B可知，DE模式下不僅信號強度比I模式更高，也能更好地展示單細胞表面細節。與圖2一致，圖3C圖中鍍金硅片上的磷脂信號強度比硅片上稍有下降，但對于細胞細節的展現有了進一步提高。而在加入基質后的圖3D圖中，信號強度提高，但成像質量有所下降，這是因為表面滴加了一層基質，覆蓋了部分細胞表面的細節。結果表明， DE模式比I模式能更好地展現細胞表面的細節，金基底加基質具有最好的離子化效率，但對成像質量有一定的影響，金基底上培養的細胞具有最好的成像質量。值得指出的是，為了保證足夠的成像信號，每張單細胞成像圖累計掃描110次，所需時間約為937 s，因此可獲得較好的成像質量圖。由于oSIMS高真空檢測環境的限制，本方法只適用于單細胞的離線分析，尚不能進行單細胞動態實時分析。
結 論
本研究測定了在不同基底上單細胞表面脂質的oSIMS離子化效率，表明金屬及基質對脂質離子化具有增強作用，與新型離子源、激光輔助后電離以及其它基質增強等方法相比，金屬/基質增強的方法具有增強效果較好、無需更改現有的儀器裝置、樣品制備簡單、不改變細胞冷凍干燥前的狀態等優勢。而只用金膜作為基底結合使用“延時提取”技術既能同時保留oSIMS成像的高質量分辨率與空間分辨率，還能提高表面不平整樣品的成像質量，在細胞表面滴加基質2，5二羥基苯甲酸后，更進一步提高了細胞表面磷脂二次離子信號。金屬/基質增強的方法主要通過將基質覆蓋于細胞膜表面，以氫質子傳遞以及貴金屬增強來提高脂質二次離子產率，而貴金屬與基質沒有接觸到細胞內部，因此本方法對于細胞內部組分信號提高效果不明顯，如果將基質覆蓋細胞內部，有望進一步增強細胞內部組分信號。 本研究結果為單細胞oSIMS分析獲得高質量成像圖提供了有效途徑，為細胞代謝、細胞藥物成像等研究提供了新的方法。
