實驗材料 Sf細胞
試劑、試劑盒 胎牛血清PBSSDS蛋白酶抑制劑裂解緩沖液
儀器、耗材 培養瓶培養箱離心機轉子水浴鍋
實驗步驟
1. 接種2.5×108 Sf9細胞于含5 ml 完全培養液/10%胎牛血清的25 cm2 培養瓶中，27℃溫育≥ 2 h。從含無血清完全培養液和重組蝕斑的1 ml 病毒貯液中取0.5 ml 分別加入各個培養瓶。4℃保存剩余的0.5 ml 重組病毒，待以后用于蝕斑試驗。
2. 培養瓶置27℃溫育4~5天，毎天檢查感染跡象。4~5天后，將培養液轉移至15 ml 離心管中，收獲病毒。
3. 于4℃1 000 g 離心10 min，將含有擴增病毒的上清轉移至一支無菌15 ml 聚丙烯離心管中。
4.
接種2.5×106 Sf9細胞于含5 ml 完全培養液/10%胎牛血清的25 cm2 培養瓶中。為每
―待測病毒貯液準備一個培養瓶，另準備一個作為非感染對照。27℃溫育≥2 h，使細胞貼壁。棄去細胞培養液并向培養瓶中加入1.5 ml
擴增的病毒貯液，27℃溫育2天。
5. 從塔養瓶中輕輕移去細胞以收獲之，并將細胞和培養液轉移至15 ml 聚丙烯離心管中。
6. 于4℃，1 000 g 離心10 min，如果目的蛋白是分泌型蛋白質，將培養上清移至一新管， 進行步驟8。如果待研究蛋白是胞內蛋白，則棄上清，用PBS輕輕將細胞團塊重懸洗滌，重復離心并棄上清。
7. 直接加入500 μl 1×SDS樣品緩沖液，煮沸細胞團塊，如因DNA的存在造成樣品太粘稠，可超聲裂解樣品，持續超聲處理直到粘性消除，然后轉至步驟9。另一變通方法是用0.5 ml 補充了蛋白酶抑制劑的適當裂解緩沖液裂解細胞團塊，4℃微量離心10 min，澄清裂解物，將上清轉移至一個新管。取0.1 ml 的各種裂解物加至100 μl 2×SDS樣品緩沖液中，在沸水浴中煮沸3 min，剩余裂解物凍存于-80℃，可保存數月。
8. 用Bradford的方法，確定培養物上清中分泌蛋白（步驟6）的濃度或細胞裂解物中細胞內蛋白（步驟7）的濃度。
9. 用下列方法中的一種分析每一樣品中的蛋白質：
（1）免疫印跡：在單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，每一泳道加入20~40 μg 細胞總蛋白。記住要包括非感染對照。
（2）考馬斯亮藍染色：在單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，每一泳道加入 20~40 μg 細胞總蛋白。如果重組病毒不純，則只有在感染細胞中重組蛋白產量很高時才用此方法檢測。
（3）功能分析：如遷移率變動的DNA結合分析，體外激酶分析（用于蛋白激酶），核苷結合分析（用于結合核苷的蛋白），胸苷摻入分析（用于生長因子蛋白質），或者任何用于檢測目的蛋白的典型分析方法。
（4）重組蛋白的代謝標記。
10. 解釋結果，以鑒定出哪一個假定的重組蝕斑是產生所需蛋白的重組子，將其進行蝕斑純化，以使其免受任何野生型病毒污染。制備大量病毒毒種貯 液，并測定重組病毒的滴度。