酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經適當方法連接而成。酶標記抗體的質量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內已有商品供應。高質量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產率高、不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質且操作簡便易行的方法。
一、工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO４ 0.05ml終止反應。
結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到最適的實驗條件。
二、酶制劑及其底物
凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：(1)來源方便，易于純化；(2)比活性高，性質穩定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。
HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3－二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經較短時間反應后呈色即達高峰（說明H２O２已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。