酪氨酸激酶分析實驗

兔肌肉烯醇化酶

1 mmol L DTT 50 mmol L HEPES（pH 7.0 ）甘油 100 mmol L 乙酸 5 × 酪氨酸激酶反應緩沖液 [γ-32P] ATP 溶液 冰 2 × SDS-PAGE 樣品緩沖液

30℃ 水浴和沸水浴

1. 4℃ 最大速度離心 5 min 相當于 100 μg 兔肌肉烯醇化酶的樣品，棄上清。

2. 加 10 μl 1 mmol/L DTT/50 mmol/L HEPES， pH 7.0，充分混勻，冰浴 30～60 min。

3. 加 10 ml 甘油，混勻。如果后續實驗在當天進行，可保持在冰浴中，否則 - 70℃保存。

4. 臨實驗前加入 20 μl 100 mmol/L 乙酸充分混勻，30℃ 水浴，5 min。保存于冰浴中，直到進行下一步操作。

5. 每個分析反應按以下比例將各反應組分加入 1.5 ml 微量離心管中：

4 μl 5 × 酪氨酸激酶反應緩沖液

1 μl 酸變性的烯醇化酶（烯醇酶含量為 2. 5 μg）

1 μl [γ-³²P] ATP 溶液（ATP 終濃度為 5 μmol/L，放射活性為 5 μCi/μl）

0～14 μl 水

蓋好離心管，30℃ 水浴，10 min。加入水的量取決于加入酶樣品的多少。每個反應的容積為 20 μl。

6. 加入 1～14 μl 有酪氨酸激酶活性的酶樣品開始反應。

7. 30℃ 水浴溫育 10 min。

8. 加入 20 μl 預冷的 2 × SDS-PAGE 樣品緩沖液停止反應，充分混勻，沸水浴 3 min，取 20 μl 進行 SDS-PAGE 電泳分析。

1. 酸變性的烯醇酶在冰浴中不要超過 1 h。

2. 步驟 6 中加入酶量的容積取決于樣品中酶活性的大小。在預試驗中所得的最大反應值可衡量磷酸轉移反應的程度。在反應中為了保持磷酸基與底物的線性結合關系可適當減小酶的加量。