賽默飛世爾科技“蛋白質組學解決方案”網絡視頻講座

　　3月30日下午，賽默飛世爾科技蛋白質組學市場專員唐佳向大家作了題為《蛋白質組學研究方法和Thermo蛋白質組學解決方案》的報告，主要介紹了以生物質譜為基礎的各類蛋白質組學的研究方法和技術手段，包括蛋白質的高通量分離和鑒定、定量蛋白質組學、翻譯后修飾蛋白質組學、Top Down 蛋白質組學等內容。

　　蛋白質組學研究內容

　　蛋白質組學的研究對象是生物體內所有的蛋白質，目標是發現它的組成和活動規律。蛋白質組學分為表達蛋白質組學和功能蛋白質組學兩類。表達蛋白質組學采用高通量的蛋白質組學研究技術分析細胞、組織和生物體內盡可能多乃至于接近所有的蛋白質，對這些蛋白質進行分離、識別、定量、定位，從而構建某個細胞、組織或生物體全蛋白質的表達譜。功能蛋白質組學以某種特定細胞、組織或生物體為研究對象，研究蛋白質的翻譯后修飾、蛋白質結構、蛋白質的定位及表達水平差異與功能之間的關系，研究蛋白質之間的相互作用及其意義，構建蛋白質功能網絡。

　　蛋白質的基本結構是氨基酸序列，通過鑒定氨基酸序列來匹配它的蛋白質，這是定性研究，是蛋白質組學研究的基礎。現在蛋白質組學研究已達到的基本研究手段是：以生物質譜技術為核心，對蛋白質進行大規模、高通量分離、鑒定和分析。以生物質譜為基礎的蛋白質組學分析方法主要有Bottom-up和Top-down兩種方法，Top-down（自上而下）技術可以直接對完整的蛋白——包括翻譯后修飾蛋白以及其它一些大片段蛋白測序，而非僅僅針對多肽；Bottom-up（自下而上）是傳統的手段，它將蛋白質的大片段混合物消化/酶解成小片段的肽后再進行分析，是在蛋白質組學的研究中較為廣泛使用的一種質譜技術。

LTQ Orbitrap Velos軌道阱質譜儀

　　蛋白質的高通量分離和鑒定

　　生物體內蛋白質種類繁多，性質復雜，數量龐大，動態范圍廣，因此，蛋白質樣品在進入質譜前要進行預分離。常規的預分離技術有二維凝膠電泳、多維液相色譜、毛細管電泳等，另外還有一些針對特殊對象的分離方法，如：去除高豐度的蛋白、對低豐度蛋白的富集分離。唐博士說，一個成功的蛋白質組學實驗必須兼顧樣品制備、LC-MS/MS分離鑒定和數據處理的分析軟件三方面，任何一方面不到位都可能導致實驗的失敗。Thermo可以為蛋白質組學研究提供全方位的解決方案，如蛋白質富集，細胞裂解、酶解，同位素標記等生物樣品前處理；液相色譜、質譜，數據處理軟件等一系列蛋白質組學鑒定、定量的解決方案。

　　LTQ Orbitrap系列是Thermo最高端的組合質譜儀。LTQ Orbitrap組合質譜儀將LTQ 與ZL的獲獎技術Orbitrap整合，在LTQ 靈敏、快速的基礎上增加了軌道阱技術的高分辨率、高質量準確度的特點，具備了從復雜體系中快速、靈敏、可靠地檢測化合物的能力。LTQ 的所有分析性能及樣品接口特點與Orbitrap寬廣的動力學范圍、卓越的靈敏度、高質量精確度和高分辨率等優點相得益彰。智能化、數據依賴的儀器控制確保了極大的分析靈活性，可方便根據不同分析問題靈活配置。在代謝物鑒定及“Bottom-up”蛋白質組學研究中，相應的數據采集及分析軟件可將LTQ Orbitrap的強大分析性能轉化成為精確、立即可用的數據信息。

　　合適的樣品前處理和分離方法，再加上高性能的質譜和數據處理軟件，這樣就可以進行高通量的蛋白質發現與鑒定、蛋白質的相對定量以及翻譯后修飾蛋白質組學研究。Protein Discoverer 軟件平臺是一個綜合性的、可拓展軟件平臺，可以對蛋白質組的數據進行定性和定量分析。取代了賽默飛世爾科技BioWorks?的Proteome Discoverer，是第一個商用的蛋白質組學數據分析平臺，使研究者們可以在一個程序中，合并、比較和分析從多個來源來的數據。 Proteome Discoverer一個主要的優點是從多種裂解方法中分析信息的能力，從而去發現更多的翻譯后修飾(PTMs)，并提高多肽和蛋白鑒定的準確度。蛋白質鑒定用的Protein Discover & Identification 是建立一個搜索樹，可以靈活選擇搜索方式，為不同的搜索建立不同的方式，建好之后統一提交進行搜索。功能多樣化，為用戶提供多種選擇。

LTQ Orbitrap電場軌道阱回旋共振組合質譜儀

　　定量蛋白質組學

　　定量蛋白質組學中比較傳統的定量方法是二維凝膠電泳，它是根據蛋白質的分子量進行二維的分離，優點是直觀可視（大的斑點即量多、小的斑點量少），缺點是對親水性或疏水性極強的蛋白質有歧視效應，操作比較煩瑣，動態范圍也受到限制。凝膠蛋白質組學定量也有標記和非標記的方法，標記的方法靈敏度比普通凝膠技術高很多。

      近年來，基于質譜技術蛋白質組學定量方法飛速發展，這些方法包括同位素標記和非標記技術。蛋白質組學定量與小分子定量有不同的地方，這些不同的地方與蛋白質組學的特性是有關系的，蛋白質表達水平是動態的，而且蛋白質種類多、動態范圍寬，作為載體的蛋白豐度很高，而與生理功能相關的蛋白（即研究者真正關心的蛋白質）豐度卻又極低。蛋白質的大規模的絕對定量其實不一定非常有意義，大部分時間是選擇性地對一些有意義的低豐度蛋白進行定量，基本的方法是先對低豐度的Biomarker進行相對定量，篩選后再進一步定量（比如絕對定量），這樣才是高效有意義的生物學方法。

　　基于質譜技術的相對定量技術，可以使用非標記的半定量技術或同位素標記的定量技術。同位素標記相對定量技術比較簡單，目前常見的有體外標記（in vitro）試劑如ICAT、iTRAQ、和Thermo公司生產的TMT；以及體內標記（in vivo）試劑如SILAC兩種。大部分體外標記試劑的原理都差不多，以TMT為例介紹體外標記的原理。一個TMT試劑有三個部分組成：質量報告子（Mass Reporter）、質量平衡子（Mass Normalizer）和蛋白質的反應端（Protein Reactive Group）。TMT現在可以同時標記6個平行試劑樣品，可以根據需要進行標記。具體的做法是，n組（比如6組）平行的生物樣本中，提取樣品后，酶解成肽段，和不同的TMT標記試劑反應標記，再將標記后的樣品送入質譜檢測。一般來說，標記試劑和N端進行反應，不會影響肽段的結構，所以肽段仍然可以送入質譜根據MS/MS譜來定性鑒定；同時標記上不同TMT試劑的樣品衍生的MS/MS報告子的分子量是不同的，根據這些報告子同位素峰的強度可推算出肽段的含量和蛋白質的表達量。比如我們可以定義一個量（比如相對量差異>1.5）就認為對比的兩個樣本有顯著的表達差異，根據這個去尋找到我們關心的生物標志物。除了N端標記，也可以選擇性地和肽段的半胱氨酸發生反應的TMT試劑，可以根據試驗選擇。

TMT試劑，紅色*號標記的是同位素標記的原子，MS/MS中會給出不同分子量的報告子，通過不同的分子量對肽段進行相對定量。

        而SILAC是在培養介質中加入穩定同位素標記的必需氨基酸，如賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）等，主要用于高等動物細胞中蛋白質的鑒定與定量（in vivo）。

       Thermo提供的軟件可對各種體內或體外標記的樣品進行分析。

　　在研究生物標記物的時候，必須先要找到那些在量上有明顯變化的蛋白質，然后再去進行深入的有針對性的研究，包括絕對定量的研究。

        除了同位素標記的方法之外，我們還進行一些非標記（Label-Free）的定量技術，它是以大量的生物質譜數據為基礎，以一定的標準來對生物樣品進行生物標志物的篩選。非標記定量技術要求儀器（如LC/MS/MS）有非常好的穩定性，這樣才能得到重現性好、可對比的質譜數據；同時也要求有專業的軟件來進行篩選工作。

　　SIEVE是Thermo提供的一款非標記定量分析軟件，SIEVE的詞義即“篩選”。它可用于批量質譜數據處理，提供出由它篩選出的有特征的蛋白質以及趨勢變化的信息，這些結果都是具有統計學意義的。它不僅可用于肽段和蛋白質，也可用于小分子，如代謝組學等（研究代謝組學時換一個數據庫）。

       在得到了一個生物標志物之后，我們就可以對選定的目標蛋白質進行絕對定量，為醫療診斷提供一個目標蛋白質定量分析的方法。醫療診斷中現在大多以抗體方法為基礎來定量，但抗體難以獲得、研究方法速度慢、抗體也很昂貴。在生物質譜中以三重四極桿技術為基礎的定量方法一直都被廣泛應用于小分子定量上，現在也可以應用于高通量的大分子肽段定量上，來高通量、低成本地進行分析。Thermo專門設計研究的三重四極桿質譜TSQ系列和PinPoint軟件，都可以在復雜的蛋白質混合物中定量痕量的目標蛋白質，并且獲得了重復性成果。這里檢測技術的一個關鍵是SRM對于肽段如何選擇合適的離子對。這里可以根據以前實驗中得到的MS/MS譜圖選擇離子對，也可以根據蛋白質序列使用SRM分析軟件在計算機模擬（in silico）的基礎上選擇離子對，這種選擇離子對的過程可使用PinPoint軟件來幫助選擇，優化選擇最好的離子對。另外，如果僅僅選擇1、2個離子對，有可能是錯的；這里可以用iSRM技術（intelligent SRM），即檢測到一個主要的SRM離子對后，可以自動觸發選擇一些次要的SRM離子對，這樣可以大大提高檢測的準確性。對于目標蛋白質定量，國外已經有一些不錯的應用。唐博士也介紹了一些國外的網絡講座。

Thermo蛋白質組學解決方案

　　翻譯后蛋白質修飾組學

　　磷酸化蛋白質組學是在蛋白質的一些氨基酸的基團上發生了磷酸化的修飾。在生物體中最常見的磷酸化類型是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸酯化；在現今的技術條件下，采用一些特殊的分離富集技術并結合生物質譜技術，已經可以實現大規模、高通量的蛋白質磷酸化氨基酸殘基的定位和磷酸化蛋白的鑒定。根據磷酸根丟失產生的中性丟失特殊峰，進行串聯質譜掃描，分析磷酸化肽段。

　　糖基化蛋白質組學相對磷酸化蛋白質組學稍微復雜一點，主要是由于糖鏈結構比較復雜。現在通過減去糖鏈的方法，如O-糖和N-糖的糖鏈去掉之后，進行大規模、高通量的糖基化位點的鑒定。由于糖鏈結構比較復雜，大規模糖鏈的解析和匹配還面臨很大的挑戰，比如說N-糖基化位點的鑒定，可以用糖苷酶除掉N-糖的糖鏈，根據增加1道爾頓的特征（去糖鏈時原天冬酰胺會被還原成天冬氨酸，分子量增加1 Da）去判斷糖基化的位點。糖鏈結構的解析采用串聯質譜的方法，比較復雜，常常需要三級以上的多級質譜來鑒定糖鏈的結構。

　　Top Down 蛋白質組學

　　Bottom-up僅能得到不完整的肽段序列，因此又開展了Top-down蛋白質組學研究。Top-down可識別與定位PTMs、RNA的可變剪接，氨基酸衍生物等等，而且可以識別和定量蛋白質的異構體isoform，進而研究通常由PTMs調控的信號和調控網絡，這些因素共同決定了蛋白質的活性狀態、定位、轉移和相互作用。Top-down蛋白質組學研究的關鍵點也在質譜和軟件，蛋白質分子量非常大，如何選擇合適的質譜條件是Top-down技術的第一步。在軟件方面，Thermo提供了ProSightPC這個軟件來支持Top-down的研究，ProSightPC可以在一個給定蛋白或肽段上鑒定一個未知質量的修飾，這個修飾可能是由于小段肽段的丟失，同源取代物，翻譯后修飾，或由于樣品前處理造成的人工缺陷，而且不需要預先知道是什么修飾。ProSightPC還可以很好地提高檢測的通量。目前而止，對5萬Da以內的蛋白質進行高通量的Top-Down已經較成熟。

   

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　　Q&A

　　網友：實驗過程中某一種蛋白質通過色譜和質譜的豐度會有多大的損失率，損失率和蛋白質的哪一種性質有關?是否能估算這種損失率?

　　唐佳博士：這個問題確實存在，若處理好的話，蛋白質的回收率可以達到90%以上，這跟儀器的條件、柱子的條件以及操作的熟練程度都是有關系的。所以，無法給出一個通用的損失率，但是損失率可以被控制。

　　網友：iSRM會不會使檢測的速度變慢?

　　唐佳博士：第一步是iSRM檢測，第二步是數據觸發，第三步實際還是檢測，雖然定義了很多，但速度還是很快的，不會影響鑒定的速度。

　　網友：關于TOP down研究，你們分子量能做到多大，比如50K的蛋白質，序列覆蓋率能有多高，你覺得這個技術現在能做到多大分子量，難點在哪?

　　唐佳博士：50K（5萬）分子量的蛋白質不是個問題，像講座中舉出的一個例子，就是分析15萬分子量的抗體。肽段的覆蓋率不僅跟質譜有關，也跟樣品處理有關，還要盡量把儀器所有的碎裂方式（如CID、HCD、ETD等等）都結合起來，這對肽段覆蓋率是很有幫助的。建議采用Bottom-up的方式去提高肽段覆蓋率，并用多種蛋白酶混合作用，數據綜合起來進行肽段的研究。

　　網友：pinpoint軟件生成的MRM的方法，我從你的講座中得到，你是高通量做MRM或iSRM方法，成功率大概是多少?比如60min的梯度，做1500個MRM，成功率多少?

　　唐佳博士：在肽段中進行離子對的檢測，是跟選擇的離子對關系很大。如果選擇的離子對特別適用，而且是實際優化，那么成功率就很大；否則，成功率就受到影響。當然，這跟實驗條件是有很大關系的。

　　網友：TMT標記和SILAC標記方法的區別?

　　唐佳博士：主要區別是：TMT是體外標記，而SILAC是體內標記。

      TMT標記是衍生化試劑跟肽段的氨基酸發生反應，是把樣品處理后，在溶液中使肽段跟衍生試劑反應，既然是衍生化反應，就需要去優化反應，以提高衍生效率，不過TMT可一次標記6個平行樣本，對于樣品也沒有什么限制（比如動物或人中來源的樣品也可以）；

      SILAC是體內標記，它不存在衍生效率的問題，它在培養基中進行標記，培養基中就含有同位素，一個是氫的同位素去標記，另一個是重氫標記的氨基酸，不過SILAC目前只能標記兩個平行樣本，并且必須針對那些可以進行培養的樣本（不可能讓生物去吃一些培養基）。

　　網友：提取蛋白過程中如何避蛋白污染的問題，請給予些建議。

　　唐佳博士：提取蛋白質常遇到人體角蛋白等的污染，一些常見的手段如：做實驗時要把所有的頭發扎起來，戴上帽子和口罩。另外，要選用質量比較好的手套和乳膠管、塑料管等。

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