質譜沙龍第十七期活動報道

發布時間：2009-04-01 09:43 原文鏈接：質譜沙龍第十七期活動報道

色譜質譜界著名專家為您揭示：我們還需做出什么努力，來迎接痕量分析的挑戰？AB總部Qtrap產品線經理現場介紹5500新看點……

2009年3月28日下午，質譜沙龍第十七期活動在第二炮兵總醫院制劑樓舉行。此次到會者除了來自發酵研究院、二炮總醫院、解放軍307醫院、軍事醫學科學院、中科院生化工程國家重點實驗室、AB公司等老朋友外，還有來自北京出入境檢驗檢疫局、天津博納艾杰爾科技、儀器信息網的新朋友。報告后的討論一直洋溢著熱烈的氣氛。

第十七期質譜沙龍活動現場

痕量檢測與有機質譜分析：系統揭示痕量分析的原理、發展和技術

首先由在色譜質譜、法醫鑒定領域享有盛譽的專家汪聰慧教授為大家介紹題為《痕量檢測與有機質譜分析》的報告。

汪聰慧教授

靈敏度為何重要？

汪教授回顧了有機質譜靈敏度的發展，從50年代的mg數量級，發展到現代21世紀的pg、甚至亞pg（幾十～幾百fg）數量級。為什么不斷追求靈敏度？汪教授舉了幾個典型的例子指出痕量分析面臨的挑戰。

比如農獸藥殘留中，蜂蜜中的氯霉素分析，要求到達ppb級的數量級。
毒品檢測方面，遇到的難題是，有些毒品（如海洛因）在人體內代謝速度相當快，在現場雖然可以對血液或是尿液進行檢測，但是幾天后即無法檢測。這樣出現了另一種技術來檢測頭發或指甲，這種技術可保存毒品的原體，即不會快速代謝掉。除保存原體的優勢外，該方法還可了解使用毒品的時間，因為頭發是在不斷生長的。雖然目前國內外都用頭發檢測毒品，但需取樣10根頭發，靈敏度還不能達到只取樣1根頭發。加入儀器靈敏度更高，可檢測1根頭發的話，就可以把頭發切成不同的段分別測定，不僅可測定毒品含量，還可測定使用的時間。
食品中污染物檢測的難點，典型的是對牛奶中二惡英的檢測，人體內每天最多允許2pg，這就對靈敏度提出很高的要求。
在興奮劑檢測方面，對甾體類化合物的檢測存在一定的難度，甾體類化合物分為外源性和內源性兩種，前種屬于人體內不含有的物質相對來說比較容易檢出，而后者在人體內本身可以合成，給檢測帶來難度，至少要求檢測濃度≤2ppb，并要求拿到全譜。

可靠性更重要！

汪教授指出當今有機質譜痕量檢測迎接的挑戰主要指兩方面，一是要在復雜體系中實現靈敏、快速、可靠、準確的分析；二是最重要的檢測基礎就是可靠準確，離開可靠性去談靈敏快速是無意義的。

以前，做復雜體系的檢測，多是前端用GC或LC分離，后面用質譜的多離子檢測，而多離子檢測的干擾很大。對于痕量確認來說，從復雜體系分析的可靠性來說，在法醫科學中，不僅要求檢出幾個離子（如SIM離子），還要求質譜必須拿到全譜，并且要求譜圖匹配率達到80%以上。而對于GC/MS/MS或LC/MS/MS，可靠性都已經大大提高；但與此同時，為了提高可靠性，除了MRM定量外，還需要做一個MS/MS全掃描譜。

下面舉例了一個對比表，來說明方法的可靠性問題：

用GC/MS SIM，如選擇3個SIM離子，可靠性是10⁶，即有百萬分之一的可能出錯；而選擇2個SIM離子，可靠性是10⁴，即有萬分之一的可能出錯。

再比如法醫鑒定用的指紋分析，出錯率是（10⁹～10¹⁰）十億～一百億分之一，故指紋鑒定技術相當可靠。而DNA分析的可靠性為10⁶～10⁷，所以沒有指紋的可靠性高。

現在在農獸藥殘留檢測中，歐盟提出了IP > 4點法，即超過4點，才能證實方法的可靠性。保留時間基本一致，要求2對以上特征離子MRM，還要考慮被選擇離子的比率要一致（被分析物和標準品相比），比如偏差正負10％。

下載參考：歐盟方法EU Guideline 2002/657/EG

汪教授還給出了幾個例子來進一步解釋可靠性的重要性和作用。

化學計量學：從復雜成分中提取更多的信息

接下來介紹了化學計量學在痕量分析中的作用。化學計量學應用數學、統計學和其他方法和手段（包括計算機）選擇最優試驗設計和測量方法，并通過對測量數據的處理和解析，最大限度地獲取有關物質系統的成分、結構及其他相關信息。

GC-MS和LC-MS聯用，也是化學計量學的應用領域。狹義的理解僅僅是：模擬信號的平滑、扣除本底、數字化處理、出一些表格和譜圖。其實，數據處理的功能不局限于此，它還能解析復雜體系內的重疊峰。廣義的數據處理也就包括了以下三個部分：峰形分析處理、模式識別、人工智能。

峰形處理一般采用去卷積法（deconvolution），一般使用兩種技術：反褶技術和交替回歸法。可解決的問題有：由于本底的干擾導致分辨率下降，引起的峰重疊/疊加，峰變形、峰位移。這些在痕量分析、復雜物分析中都常常遇到。

靈敏度的問題

現在儀器的靈敏度相當高，但在實際應用中好像還覺得靈敏度不夠，主要是由三個問題引起：（１）前處理；（２）質譜；（３）色譜柱。

第（1）個問題——前處理問題非常重要，很多決定著試驗的成敗。

前處理的手段包括：
a) 溶劑萃取
b) 快速溶劑萃取：即用加壓、加溫的方式來提取，主要效果是快速、耗費溶劑少
c) 固相萃取
d) 凝膠滲透萃取：GPC Cleanup
e) 免疫親和試劑法

在固相萃取方面，汪教授特別介紹了新型的QuEchERS方法，其主要特點是回收率高、重現性高。

從前處理的選擇性上看，免疫親和方法 > SPE > GPC，GPC是在大類上去除大分子，得到待分析的小分子。而免疫親和是極其特異性地去除所有雜質干擾，直接獲得待分析的小分子，處理過程相當簡單，它是凈化效果最好的一種，但是代價昂貴。SPE介于二者之間，但并不能完全除去雜質。從某種程度上來說，當前處理凈化后只剩余小分子時，GC、LC應該都能達到較好的效果。

（2）質譜的問題，主要指應把質譜儀器調整到正常狀態（不是最高狀態，而是正常狀態），要對儀器要時常核查，保證其處于正常狀態。質譜本身來說，離子源、真空系統對靈敏度的貢獻最大。

（3）色譜柱的問題：汪教授也舉例了色譜柱對靈敏度、分離度的影響，并闡述了重要性。

快速和高通量

要想實現快速的痕量分析，脫離不開自動化，目前已出現了很多儀器，比如自動頂空、熱脫附、固相萃取和固相微萃取、GPC＋自動濃縮。高度的自動化，將使分析速度加快。

樣品的污染問題

樣品的污染是指前一針做完，洗針后，還是有前一針的樣品殘留。對于HPLC，有一項指標是自動進樣器的交叉殘留。從現有廠家公布的結果來看，島津和資生堂的自動進樣器交叉殘留最小。交叉殘留常見的指標是：0.1%，0.05%（無底座，Loop進樣）、0.005%（只有少數幾家，如島津、資生堂）。洗針的方式也比較重要，比如超聲清洗就比浸泡清洗效果好。在殘留檢測中，為減少殘留，很多要不斷洗針，就會耽誤時間。無縫的針也是一種解決的辦法。

定量準確性

主要介紹質譜的Cross talk（交叉污染）效應。Cross talk的定義是：MRM分析時，母離子不同，子離子相同，前面還沒有離開碰撞室，后面的就開始碰撞。這時前一個MRM通道就會對后一個MRM有干擾，定量就不準確。要進行幾百對離子的分子的分析，必須降低Cross Talk。

幾家公司都從一定的技術上來減小Cross talk效應，比如LINAC技術（AB公司）、T-Wave技術（Waters公司）、Instantaneously Dump瞬間去除（Thermo和Varian公司）技術。

精彩的報告結束了，大家還無限回味，踴躍提問。比如問道QuEchERS方法是過濾或離心的問題。從實際效果上看，由于填料的密度較小，所以用離心可能會漂浮，所以用過濾的方法會更好。目前，國標還是用傳統方法，因此對人的操作要求較高；而QuEchERS方法最突出的特點是對人的操作要求不高，回收率重現性很高。

報告下載：痕量檢測與有機質譜分析

本網收錄前沿Lab：中國農科院農業環境與可持續發展研究所分析測試中心

相關鏈接：

農藥多殘留分析中QuEchERS方法介紹

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果蔬中54種農藥殘留的QuEChERS/GC-MS快速分析

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Qtrap 5500在定量方面的應用

AB公司的Mauro Aiello博士向大家介紹了Qtrap5500系列質譜儀及其在定量分析中的應用，AB公司的李丹博士為大家進行了詳細的同步翻譯。Mauro Aiello博士是API 5000的主要設計人之一，現在是Qtrap產品線經理。

AB公司Qtrap產品線經理 Mauro Aiello博士

AB公司李丹博士

AB從去年秋天推出了5500和5500 Qtrap儀器。這一代儀器相比前一代或前幾代儀器，體積非常小；有和前代同樣的TruboV源，和新的離子光學：

（1）彎曲的碰撞室減少了44％的體積；減輕分子泵的壓力（只需一個分子泵）
（2）相比API 5000，Q-Jet加長，是原來的2.5倍（API 5000為5cm，5500為12.5 cm）
（3） Q3也是線性加速的，使離子可以快速到達檢測器。同時，加速的線性離子阱，在達到2000 amu/sec速度時，可達到很精確的分子量。

相對于API 5000的改進

5500系列在靈敏度上做出了一些改進，（1）3.5倍大氣真空壓力；（2）離子引導Qjet相對于5000是加強的；（3）ZL設計的彎曲碰撞室；（4）減少分析器的壓力從而降低對發射離子的影響；（5）在固定電荷領域里面加大射頻電壓。

Qtrap5500系列沿用了Turbo V?離子源系統，該系統的優點：噴針和錐孔呈90度夾角；兼顧ACPI源；易于拆卸清洗；能達到大流量。（順便，李丹博士提到，昨天拜訪客戶，談到AB在大流速測定時的優勢，客戶問道：走大流速會提高靈敏度，但有人會抱怨噪音會增加怎么辦？Mauro Aiello博士告訴了客戶TurboV的使用訣竅：可降低噴針電壓，如從5500 V降低到1500 V，會顯著降低噪音，S/N有意想不到的提高。）

Qtrap5500采用了12.5cm的Qjet離子傳輸裝置，比5000（5 cm）在長度上大出2.5倍；Qjet離子傳輸裝置屬于AB公司的ZL技術，跟其它的六極桿、八極桿不同，該技術僅僅是利用射頻電壓使電子快速導入Qo中，同時可以使離子更好聚焦，對真空有優勢，并提高靈敏度。

Mauro Aiello博士還舉例顯示了：

（1）快速采集數據，靈敏度不損失：Qtrap5500當dwell time（離子駐留時間）從1,000 毫秒降低到1毫秒時，靈敏度并沒有降低。

（2）快速采集數據，不損失數據質量：Qtrap 5500的創新設計使其即使在2毫秒的駐留時間（dwell time）、2～3毫秒的MRM切換速度下，不降低數據質量，因此真正解決了當前MRM速度的瓶頸。同時，正負離子掃描切換時間能夠達到50ms。

接下來介紹了Qtrap5500和超快速液相色譜（島津UFLC）聯用時的性能表現，實驗基本參數為：1.25mL/min的大流速，柱溫控制在45°，Agilent < 2um柱子，沒有分流，1 min的梯度。對75種殺蟲劑、150對MRM離子對進行快速定量分析，通過實驗得出，如果縮短每一個MRM離子對的檢測時間（cycle time），就會得到十分準確的峰圖；因為如果用傳統方法長時間檢測，在快速液相這種方法中會丟失很多峰。該技術使檢測時間（cycle time）從10ms縮短到5ms，時間降低了50%，從而CV值由9.1%降低到5.5%。同時，縮短MRM檢測時間，并沒有出現交叉污染（cross talk）問題。最低檢測限CV 3%，定量線性范圍是105。

穩定性測試：對Qtrap 5500進行穩定性實驗，在連續3天內進行1300針的血漿進樣，CV值變化在3.3%，證明儀器了穩定性。

相對于Qtrap4000的改進

相同點是：都采用了Turbo V?離子源和線性離子阱；不同點是：Qtrap5500采用更為耐用的檢測器，體積由于采用了彎曲設計相對縮小了44%，三重四極桿靈敏度提高了5～10倍，線性離子阱靈敏度普遍提高50倍以上（根據被測化合物性質的不同提高10～100倍），并實現了更快的正負離子切換（提高了10倍）。

通過對Q3上也應用線性加速的功能，使得快速導入更多的離子到檢測器，同時對空間電路革新（fringe filed技術）來實現線性離子阱靈敏度的提高。在冷卻過程中加入脈沖氣體，減少了離子阱碎裂時間，從而提高了掃描速度可到20,000Da/Sec。在Qtrap5500可以很清楚地看到碎片峰的出現。

由于Qtrap 5500靈敏度很高，在復雜基質的代謝物鑒定中，使用Qtrap5500可以對樣品進行稀釋從而降低生物基質的影響。舉例了一個實驗，Qtrap5500（5 min液相，20,000 amu/sec），4000 Qtrap（30min液相，4,000 amu/sec）作代謝物鑒定的實驗，同樣獲得很好的結果。在二級碎片峰的靈敏度和未知物鑒定上，Qtrap 5500相對于Qtrap 4000擁有更為豐富的譜圖，更有利于進行庫檢索來鑒定未知物。

創新的MS3定量方法（MS3Quant）

Qtrap5500采用了創新的MS3定量方法，具體就是在Q1選擇母離子，在Q2彎曲碰撞室里打碎選擇子離子，子離子再到線性離子阱里面進行離子阱的碎裂，找到特征的三級碎片峰。由于掃描速度很快，所以Qtrap5500可以實現MS3定量的方法。

MS3Quant的主要優勢是針對基質復雜的樣品大幅提高S/N。舉例顯示了在沒有生物基質時，S/N并沒提高，而在生物基質中，MRM 的S/N＝10，MRM3的S/N提高到147，獲得了本質性的飛躍。另一個例子顯示了相對于傳統MRM，MS3 定量可以明顯分離出非目標化合物，信噪比得到提高，減少了生物基質對目標樣品的干擾。

Qtrap5500其它技術上的優勢

Qtrap5500其它的優點在于可以和其它的離子源兼容，全新的1.5版本工作站，氣體要求和API 5000相當，由于體積縮小所以采用單個的機械泵和分子渦輪泵，對泵的要求減少。

新的設計使Qtrap5500系列擁有一個工作試驗臺，可以把氮氣發生器放進里面，由于整體體積的縮小，可以在儀器上面放置流動相和色譜系統實現一體化操作。

最后總結了Qtrap5500系列質譜儀的優勢：與Qtrap 4000相比，MRM和離子阱掃描靈敏度都得到了很大程度的提高；創新的MS3定量方法通過三級碎片峰對樣品進行定量分析，減少了生物基質的干擾；可以同時實現定性定量分析；整個檢測限有了一個提高，減少樣品前處理過程或者是減少實際樣品的消耗量。

本網站收錄的相關產品：QTRAP5500 四極桿-線性阱雜交質譜儀

HPLC-MS-MS法研究鹽酸奧洛他定片人體藥代動力學

來自解放軍307醫院臨床藥理室郝光濤老師，為大家介紹了題為：《HPLC-MS-MS法研究鹽酸奧洛他定片人體藥代動力學》的報告。

解放軍307醫院臨床藥理室郝光濤老師

解放軍307醫院是軍事醫學科學院附屬醫院，是國家藥物臨床實驗機構，主要的研究工作是人體藥代動力學和一期臨床試驗，質譜方面主要應用串聯四極桿進行定量工作，接下來郝光濤老師為大家介紹了HPLC-MS-MS法研究鹽酸奧洛他定片人體藥代動力學的研究項目。

鹽酸奧洛他定（Olopatadine Hydrochloride）首先是由日本開發的新型抗過敏藥物，2000年在美國首次獲得上市許可。用于抗過敏性鼻炎，抗蕁麻疹，改善皮膚病伴瘙癢癥狀的治療。該藥物主要研究方向是在中國健康人體內的藥代動力學特性，為臨床安全、合理用藥提供參考依據。

本試驗選擇健康成年志愿者12名，男性6名，女性6名。采用隨機單次口服給藥，使用HPLC-MS-MS方法（1200-API 3000）檢測人體血樣和尿樣中的藥物濃度，研究該藥物在人體內吸收、分布、代謝及排泄的規律。MRM離子對：奧洛他定（338—247），內標地西泮（285—193）。

在上述工作完成的基礎上，郝老師系統地介紹了國家藥代動力學的指導原則所要求的考察項目，并根據該原則設計的實驗及獲得的結果。

? 特異性(Specificity)：LC/MS/MS法比較特異（略）
? 基質效應（Matrix）
? 標準曲線和定量范圍（Calibration Curve）
? 定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）
? 精密度與準確度（Precision and Accuracy）
? 樣品穩定性(Stability)
? 提取回收率（Recovery）
? 方法學質控（QC）

基質效應

郝老師重點介紹了基質效應。在采用質譜方法研究時基質效應對定量分析的影響非常大。FDA和我國SFDA注冊審評時要求對基質效應進行考察，但用什么方法考察還沒有明確的規定。通用的方法是考察絕對基質效應或相對基質效應。

絕對基質效應：通過調節色譜柱或液相的各種條件，目的是使被測藥物和基質能夠分離開不存在干擾；相對基質效應：在檢測生物樣本時，雖然基質對定量有干擾，但把干擾控制在一定范圍內，使其對檢測結果影響控制在±20%之間。

該研究采用最低定量限來考察相對基質效應，具體方法是選擇6名不同受試者，服藥后空白血液或尿液，通過對最低定量限的考察，如果最低定量限的偏差在±20%之間，那么就可以說明該方法的基質效應是過關的，不影響數據測定的結果。該方法適用于大批量生物樣本的檢測，節省時間和成本。在此基礎上，美國大藥廠有時要求用低、中、高三種濃度來考察相對基質效應。

絕對基質效應一種是用標準品直接進樣，另一種是用三通接入，一邊注射樣品，再注射進基質，看藥物基線是上升還是下降。這種方法一是麻煩，二是不能體現出數據。而上文也談到，6名不同受試者，最低定量限偏差±20%是可以體現數據的。

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標準曲線和定量范圍

要求定量范圍能覆蓋全部待測生物樣品的濃度范圍，對于個別濃度高的樣品進行稀釋后也可再進行測定。

定量下限

定量下限要求滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度，或能檢測出Cmax的1/10～1/20的藥物濃度。

精密度與準確度

精密度考察就是一天對一批樣品的低、中、高三個濃度分別進行檢測，郝老師對此也提出了自己的一點疑問：如果一批樣品中一個樣品檢測結果不正確，單獨對該樣品進行重復檢測，直至達到批量的要求，而不再對整批樣品檢測，該方法是否可行？在座的幾位專家倒是覺得可行，因為偶然的失敗是可能的，但只要數據可溯源，實驗有完備的記錄就可以。準確度也是對一批樣品的低、中、高三個濃度進行檢測，利用±15%的相對回收率進行考察。

樣品穩定性

樣品穩定性主要進行四個方面的考察，首先進行生物樣品在室溫條件下4h的穩定性；第二是樣品處理后在進樣器中的穩定性，考察時間一般為4～6個小時，保證一批樣品完全進樣來確保數據的真實性；第三是考察生物樣本反復凍融三次的穩定性；最后考察的就是生物樣品長期放置的穩定性，時間一般為1個月。

提取回收率

提取回收率主要是進行液液萃取和固相萃取的方法進行考察。

方法學質控

以上考察方面合格以后，最后進行未知樣品的生物測定。需要提供低、中、高三個濃度的質控樣品，根據指導原則數量不能小于每批樣品的6%，最多允許有2個不合格樣品，但是這兩個樣品濃度不能一樣。

最后郝老師給大家展示了該方法藥代動力學參數、血藥濃度時間曲線和尿藥累積排泄曲線的檢測成果。

報告下載：HPLC-MS-MS法研究鹽酸奧洛他定片人體藥代動力學

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API 3000三重四極桿液質聯用儀

Agilent 1200液相色譜系統

MAS：一種解決生物樣品中強水溶性化合物提取的新型通用方法

最后由來自天津博納艾杰爾科技有限公司的胡雪艷工程師為大家介紹了《MAS：一種解決生物樣品中強水溶性化合物提取的新型通用方法》的報告。

天津博納艾杰爾科技有限公司胡雪艷工程師

MAS方法開發的目的

胡工首先指出MAS是一種樣品前處理方法，是主要針對生物樣品中強水溶性化合物的一種新型前處理方法。

MAS的定義及流程示意圖

在講解MAS方法之前，胡工首先提到了基質固相分散萃取和QuEChERS這兩個概念。前方法的特點就是將樣品的基質和吸附劑填料混合在一起，然后通過溶劑洗脫得到目標化合物；后一種方法主要特點之一是介質分散固相萃取，另一主要特點為利用硫酸鎂直接除水。

MAS方法是在上述兩種方法的基礎上，對固相萃取的進一步發展和完善。MAS方法即“多重機制雜質吸附萃取凈化法”，主要通過多官能化的復合吸附材料，將生物樣品中的主要干擾基質吸附，強水溶性的被測物質留在樣品溶液中而達到凈化和富集的目的。

MAS流程示意圖

操作流程首先將樣品基質和提取溶劑同時放入離心管中，然后進行震蕩或超聲提取，通過溶劑可以將樣品中的目標物提取到溶劑中；然后加入SPE填料吸附凈化樣品基質干擾，離心后檢測目標物被留在了溶液里；最后取上清液進行后處理或直接檢測。

MAS方法的特點、優點及應用

一般的SPE方法需要活化柱子、上樣、淋洗和洗脫這四個步驟，而MAS方法只需吸附樣品雜質，達到提取和凈化一步完成；另一特點就是使用多官能團吸附材料，同時除去多種雜質。優點是簡單、高效、成本低、對操作人員的要求低。

MAS產品適用于瓜果蔬菜等樣品基質、葉綠素較多的樣品基質、含脂肪較多的樣品基質、生物樣品等小樣量樣品、去除酸性雜質以及肉、蛋、奶制品中三聚氰胺的樣品前處理工作。

為闡述MAS方法的效果，胡雪艷工程師比較了在測定血清樣品中藥物及藥物代謝物中，四種前處理方法的效果。見圖1～圖4，同Waters Oasis HLB小柱處理結果（圖4）相比，直接蛋白沉淀法（圖3）去除了大分子，但小分子雜質存在干擾。而圖1和圖2的MAS方法，都取得了很好的效果。那么，圖1所用的MAS離心管式蛋白沉淀法優點就是：步驟簡單、便宜、去除效果好；圖2所用的MAS SPE方法優點就是：便宜、去除效果好。但在座的某些專家提出了兩點疑問，也希望Agela公司通過更好的實驗來證實。（1）所選用的色譜柱是ASB C18，并不是一根可以分離大蛋白的柱子，所以，雖然圖1～圖4都“顯示”了凈化掉了大的蛋白，但柱子本身也許根本就不會在10分鐘以內得到蛋白的峰。（2）該實驗實際假設了Waters Oasis HLB小柱的處理效果很好，但是并沒有后面諸如質譜的直接證據來證實，的確去除了干擾的雜質，而不是去除了樣品。