質粒的轉化及轉化子的鑒定實驗

實驗方法原理 熱激法：大腸桿菌在0 ℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42 ℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。

實驗材料 外源片段與載體的連接產物大腸桿菌感受態細胞

試劑、試劑盒 X-galAmpLA培養基水抗生素

儀器、耗材 培養皿滅菌鍋離心管搖床

實驗步驟

1.  l ml X-gal (20 mg/ml)，25 ml Amp（100 mg/ml），250 ml制備選擇性培養基平板：在融化的250 ml LA培養基中250 mI PTG (200 mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養皿中；

2.  取出3管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；

3.  每100 μl感受態細胞加入約20 ng質粒DNA，3管分別加連接產物、標準超螺旋質粒DNA（陽性對照）及不加入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；

4.  熱擊：將離心管放置42 ℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5.  冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；

6.  SOC培養基，在37 ℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；復蘇：每管加400 μl

7.  布皿：取適當體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；

8.  培養：倒置培養皿，于37 ℃培養12－16小時 即可觀察到藍白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色菌落是載體自連的轉化子）