實驗室診斷最好的方法是分離培養、檢測解脲脲原體抗原或核酸成分。注意采集新鮮標本（精液、前列腺液、陰道分泌物、尿液等）并立即接種。若不能立即接種，應將標本放4℃冰箱保存，在12h內接種。解脲脲原體的分解可用加尿素和酚紅的含血清支原體肉湯。肉湯內可加青霉素抑制雜菌生長。解脲脲原體具有尿素酶，可分解尿素產生氨，使培養液中酚紅變紅，但培養液澄清不出現渾濁，表示陽性。在固體培養基上用低倍鏡顯微鏡觀察，可見有微小的油煎蛋樣或顆粒樣菌落生長。免疫斑點試驗（IDT)或ELISA法可用于檢測解脲脲原體抗原或鑒定解脲脲原體培養物。