通過以血清的各種反應為中心的機體免疫反應和變態反應的研究體系來篩選新抗原和新基因。
| 實驗材料 | |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | TBST 裂解液 血清 NZY top IPTG 一抗 二抗 SM 封閉液 MgSO4 LB AP BCIP-NBT 顯色液 |
| 儀器、耗材 |
一、E.coli/phage 裂解液預吸附血清
1. 將E.coli /phage lysate 以1:10-20 稀釋在TBST 溶液中。
2. 將4 張82mm 的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的E.coli/ phagelysate 中，室溫下水平搖動30 分鐘，取出NC 并使膜瀝干。
3. 用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分鐘。
4. 用濾紙輕輕吸去膜上的液體。
5. 將膜放入50ml 封閉液中，室溫下水平搖動最少30 分鐘。
6. 將膜從封閉液中取出，用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分鐘。
7. 將血清按1:5 稀釋在TBST 溶液中，將一張膜放入溶液中，37℃下輕輕水平搖動10 分鐘。
8. 從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一張新膜,37℃下輕水平搖10 分鐘.
9. 重復步驟8，直至所有4 張膜都處理完。
10. 除去最后一張膜，收集血清（prima ry antibody），分裝成小份儲存于-80℃冰箱中待用。
注意：
該步處理過程是為了去除血清中能與細菌和噬菌體裂解蛋白進行免疫反
應的抗體，這樣可以減少假陽性率；
一抗不能反復凍融，化凍后不要再次冰凍，可放于4℃作短暫保存；
可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，則需要至少10個病人血清進行混合；
二、噬菌體篩選
1. 準備NZY agar plates（至少用前24 小時倒好），用前在37℃培養箱中烘烤1-2 小時以去除水滴。
2. 將過夜培養的XL1-blue MRF’細菌2000 轉/分，離心10 分鐘，將細菌溶解在10mM MgSO4 中，調整細菌濃度為OD600=0.5。
3. 融化NZY top，并將NZY top 放在50℃水浴中。
4. 將適量的XL1-blue MRF’細菌溶液與一定稀釋度的phage 文庫混合，37℃下共同作用15 分鐘。
直徑90mm 平板：200μl XL1-blue 細菌+適量的phage 文庫
直徑150mm 平板：600μl XL1-blue 細菌+適量的phag 文庫（噬菌斑數量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）
5. 將步驟4 中的混合液與NZY top 溶液混合（200μ l 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600μ l 混合液+8-10 ml NZY top 溶液），倒入到NZY agar plates 中，室溫下放10 分鐘左右，然后倒置放于37℃下培養。
6. 當噬菌斑剛好可看到時（大約5-8 小時），從培養箱中拿出平板。
7. 將NC 放入10mM IPTG 溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好3 個不對稱的標記。
8. 將IPTG 處理好的NC 貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于37℃下培養。
9. 過夜培養后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養基粘在膜上。
10. 將膜放于50ml TBST 溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜3 次，每次10 分鐘。
11. 將膜放入50ml 封閉液中，水平搖動，封閉4-6 小時。
12. 在封閉液中加入適當滴度的一抗，水平搖動處理過夜。
13. 將膜放于50ml TBST 溶液中，洗膜3 次，每次10 分鐘。
14. 在封閉液中加入適當滴度的二抗（各個公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動1-2 小時。
15. 將膜放于50ml TBST 溶液中，洗膜3 次，每次10 分鐘，最后用50ml TBS溶液洗膜15-20 分鐘，取出膜空氣中瀝干。
16. 將膜放入BCIP-NBT 顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點可見為止。
17. 從顯色液中取出膜放在TBS 溶液中，空氣中使膜干燥。
18. 根據所做的標記,將膜與平板對齊,將平板上對應的陽性克隆區域的培養基挖出放入500μl SM buffer 中,并加入25 ml chloroform,4℃貯存（最多可貯6 月）。