一、植物組織蛋白質提取方法 1、根據樣品重量（1g 樣品加入 3.5ml 提取液，可根據材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。 2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4 小時）。 3、用離心機離心 8000rpm40min4℃或 11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 這種方法針對 SDS-PAGE，垂直板電泳！ 二、植物組織蛋白質提取方法三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨葉片 2、加入樣品體積 3 倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心（4℃8000rpm以上 1 小時）棄上清。 3、加入等體積的冰浴丙酮（含 0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上 1 小時），然后真空干燥沉淀，備用。 4、上樣前加入裂解液，室溫放置 30 分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離 心（15℃8000rpm 以上 1 小時或更長時間以沒有沉淀為標準），可臨時保存在 4℃待用。 5、用 Brandford 法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃備用。 藥品：提取液：含 10%TCA 和 0.07%的β-巰基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素 0.2gCHAPS 溶于 3ml 滅菌的去離子水中（終體積為 5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點！當然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會減少！ 三、組織：腸黏膜 目的：WESTERN BLOT 檢測凋亡相關蛋白的表達 應用 TRIPURE 提取蛋白質步驟：含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒轉混勻，置室溫 10min 離心：12000 g，10min，4 度，棄上清加入 0.3M 鹽酸胍/95％乙醇：（2ml 每 1mlTRIPURE 用量） 振蕩，置室溫 20min 離心：7500g，5 min，4 度，棄上清重復 0.3M 鹽酸胍/95％乙醇步 2 次沉淀中加入 100％乙醇 2ml 充分振蕩混勻，置室溫 20 min 離心：7500g，5min，4 度，棄上清吹干沉淀1％SDS 溶解沉淀 離心：10000g，10min，4 度取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的問題：加入 1％SDS 后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4 度離心后又多了 白色沉定，SDS 結晶測濃度，含量才1mg/ml左右。解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加 2X BUFFER，然后煮5－10 分鐘，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根 1、200 毫克樣品置于冰上磨碎 2、加 lysis buffer，離心，10000rpm，4 度，5min 取上清 3、重復離心 5min lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 五、蛋白質樣品制備 秧苗蛋白質樣品的提取按 Davermal 等（1986）的方法進行。 100mg 材料剪碎后加入 10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用
液氮研磨成粉，加入 1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含 10mM 即 0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀 1
小時，4℃，15000 r/min 離心 15 min，棄上清， 沉淀復溶于 1.5ml 冷丙酮(含 10 mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀
1 小時，同上 離心棄上清，（有必要再用 80％丙酮(含 10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真 空抽干。 按每mg干粉加入 20 μ l
（可調）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine (Amersham
Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton
X-100]，37℃溫育30min，期間攪動幾次，28度（溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min
離心15min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳。或者-70 度保存 六、植物根中蛋白質的抽取 (1) sample, 液氮研磨 (2) 裝 1.5 ml centrifuge 用 tube (3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul (4) 12000 rpm, 4 度, 10-15minite (5) 取上層液，蛋白質就在里面