質粒快速鑒定
試劑:
Protoplasting buffer:
30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M
5mM EDTA 0.1ml/0.5M
50mM NaCl 0.1ml/5.0M
20% Sucrose 5ml/40%
50 μ g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml
50 μ g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml
補水至10ml,-20℃分裝保存。
Lysis buffer:
89mM Tris-HCl, pH8.0
89mM boric acid 2ml of 5×TBE
2.5mM EDTA
2% SDS 2ml of 10%
5% sucrose 1.25ml of 40%
0.04% bromphenol blue 4mg
補水至 10ml , - 20℃分裝保存。
步驟:
1 .將轉化后的菌液鋪平板, 37 ℃ 過夜培養。
2 .配制 0 .6--0 .7% 的瓊脂糖 TBE 膠。
3 .用連續加樣槍在 96 孔板中每孔加入 10 μ l Photo plasting Buffer 。
4 .用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至含有 Photo plasting Buffer 的 96 孔板中,振蕩混勻。
5 .用連續加樣槍將 Lysis Buffer 上樣于凝膠中,每孔 4 μ l ,用排槍將細胞與 Protoplasting buffer 混合液 上樣于凝膠中(細胞在 Protoplasting buffer 中不宜超過 30-40 min ),并點上Marker 。
6 .調節電壓為 20V (小槽)或 40V (大槽),電泳 15min ,使細胞充分裂解,將電壓調高到 200V ,繼續電泳 1hr ,照相。
7 .根據膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。
2 .菌落 PCR
1.取適量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的滅菌水。