熒光素FITC標記抗體的方法

當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時，主要是蛋白質上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵（thiocarbmide）結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般zui多能結合15～20個，一個IgG分子可結合2～8個分子的FITC，其反應式如下

FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質

常用Marsshall（1958）法標記熒光抗體，也可以根據條件采用Chadwick等標記法或Clark等（1963）的透析標記法。

1．Marsshall法

（1）材料 抗體球蛋白溶液、0．5mol／L（pH9．0）碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。

（2）方法及步驟

①抗體的準備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。
　 ②熒光素的準備 根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
　a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
　 b．總蛋白量（AXB）＝Crag。
　 c．C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20）。
　 d．熒光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg。
　 e．巳0．5mol／L（pH9．5）碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
　 f． PBS量D-（B+F）=Gml。

注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。
　 ③結合（或標記） 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁（大約在5—10min內加完），加完后，繼續避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
　 ④透析 結合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析（0～4~C）過夜。
　⑤過柱 取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2）；過濾量：12ml標記蛋白液（過濾前未透析）；收集量：20ml（稀釋1．7倍左右）。

2．Chadwick法

（1）試劑和材料 抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。

（2）方法及步驟

①抗體準備 用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內，放于冰槽中。
　 ②熒光色素準備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。
　③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結合（在磁力攪拌機上持續攪拌）18～24h。
　 ④透析和柱層析 方法同Marsshall法。
 

3．改良法

（1）試劑和材料

①0．01mol／L（pH7．2）PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸餾水
　②0．5mol／L（pH9．0）碳酸鹽緩沖液配法 取0．5mol／LNazCOs（5．3％）10ml加入0．5mol／LNaHC03（4．2％）90ml，混合后，校定pH至9．0。
　 ③3％碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
　 ④其他試劑和材料 l％疊氮化鈉、離心機及離心管、燒杯（25m1）、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500m1）透析袋等。

（2）方法及步驟

①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0．15mol／LNaCl）及緩沖液（0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0）稀釋使每毫升內含蛋白質lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。
　 ②加入異硫氰酸鹽（FITC）熒光素[蛋白：熒光素＝（50—80）mg‘lmg]，在0～4~C
下電磁攪拌12～14h。
　③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止）。
　 ④將制備好的熒光抗體加疊氮化鈉o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。

4．透析標記法

此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。

（1）試劑和材料 試劑和材料同改良法。

（2）方法及步驟

①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。
　　②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內，并使透析袋浸沒于FITC液中。
　 ③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。