熒光素標記抗體技術

(一)　原理

　　目前用于抗體標記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價結合，標記后的抗體仍保持與相應抗原結合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發下產生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測。

　　(二)　操作步驟

　　　　將純化的IgG抗體對PH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，
　　　　透析后抗體液移入小燒杯中

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
　　　　使終濃度為1mgFITC／1mlDMSO
　　　　FITC／IgG比例:如IgG濃度為1mg／ml，FITC／IgG比例約為50μgFITC／mgIgG；
　　　　如IgG為5～10mg／ml，則比例為25μgFITC／ml IgG
　　　　在10ml小燒杯中先放入抗體

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中

　　　　　　　　　　　↓

　　　　將標記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h

　　　　　　　　　　　↓

　　　　用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素，先用25ml PBS淋洗G25柱

　　　　　　　　　　　↓

　　　　收集PBS洗脫第一個熒光素結合蛋白峰，測定F／P
　　　　比值。第二個熒光素峰為游離熒光素

　　　　計算:

　　　　　　　　　2.87×A495
　　　　F／P＝────────
　　　　　　　　A280-0.35×A495

　　　　合適的F／P值為2～4。

　　(三)　試劑器材

　　1.　純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

　　2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。

　　3.　PBS、DMSO

　　4.　PH9～9.5碳酸鹽緩沖液: Na₂CO₃4.3g，NaHCO₃ 8.6g加蒸餾水至500ml。

　　5.　PD10柱(Sephadex G25柱)

　　6.　磁力攪拌器，紫外分光光度計等

　　(四)　注意事項

　　1.　FITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取，以避免潮解。

　　2.　FITC-DMSO液要臨用時配制。

　　3.　碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。