引物的設計相對于普通的PCR來說，還是有一些更為嚴格的要求：1、引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；2、引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；3、引物一般要設計在目的基因中跨內含子的位置，這樣可以避免在存在DNA污染的情況下，對目的片斷的額外的擴增；4、對于定量PCR來說，特別是在使用sybr green的情況下，引物二聚體的存在對結果的干擾較大，所以在選擇引物時要盡量避免容易形成二聚體的引物。
