這個技術手冊介紹了熒光壽命（ FLT）這種新技術的基本原理。從這本技術手冊里，我們可以簡單的了解與這項技術相關的理論基礎和與之配合的實驗條件，以及通過一項應用實例討論了如何對實驗中所獲得的數據進行解析和歸類的方法。
1.微孔板技術在高通量篩選中的價值
使用者利用一個 marker或者是標記物受光激發后，通過一臺普通的微孔板閱讀器，就可以監測生化和生物反應進程。常用的讀取模式包括檢測吸收光，熒光強度(FI)，熒光偏振（FP），時間分辨熒光（TRF）。一般沒有方法能夠包含所有可能的分析模式，如果達到這樣的高分析程度，需要一個配套的方法能夠覆蓋盡可能寬的實驗范圍。盡管如此，，還是會有一種方法被優選選擇，通過它能夠得到更可靠的數據，更高端的信息，以及迅速的讀取數據。
熒光壽命被定義成熒光分析在回到基態之前駐留在激發態的時間。熒光壽命對熒光標記物周圍的微環境高度敏感。當標記一個反應對，由于化學反應改變這個反應對的狀態（例如在酶反應體系中）或者是發生了與其他結合伴侶的結合（例如受體 -配體的結合），將影響到上面所提到的微環境。
無論如何，檢測熒光壽命將直接指示反應環境。這類信號要遠遠強于通常會影響其它探測方法的干擾信號，因此它將為市場需求加入巨大的推動力。
Tecan Ultran Evolution detection platform已經融入了對熒光壽命的檢測。除了已經發展的各種檢測方法以外，這項新技術使得Ultran Evolution技術平臺具有更強的市場應用前景。
2.熒光壽命測定的原理
用 Ultra Evolution測定熒光壽命采用的一種方法，稱作時間關聯的單光子計數（TCSPC）。
一個脈沖激光器重復激發樣品。調節激發脈沖的強度，使得對于任何一個脈沖，在探測器上只有一個光子被計數。按照測量的激光脈沖和探測器感應之間的這段時間，將計數值引入已用熒光計數和時間繪制的柱狀圖。這個基本實驗的千萬分之一的重復的數據積分會產生一個平滑的曲線，它代表的就是一條熒光衰減曲線。為了確保單光子計數模式，實驗中采用的計數速率相當于激發速率的 1%。ULTRA Evolution的光源的激發速率為25到100納秒產生一次脈沖，從而使得使用者在不到一秒中能夠在探測器上收集到1千萬個重復計數。
一個相關的參數值被稱作衰減曲線的動態范圍，將它定義成最大計數與背景值的比值。使用 Ultra Evolution reader，能夠得到跨度大約三個數量級的衰減曲線。動態范圍越大，最后得到的信號越準確。
這個過程的時間范圍大約是納秒級的，它比通常的測定時間要快一百萬倍。因此，在熒光壽命檢測和標準檢測模式之間的最主要的技術差別，是它避免了時間平均化。 Whilst FI，FP等，需要通過一段長時間的時間檢測對信號累計積分，熒光壽命分解了這些過程，因此用它可以對分子進行動態觀測。這個法則被稱作"時間顯微術"。
3. 熒光壽命數據還原的原則
將熒光強度，熒光偏振，和熒光壽命檢測對比后，最顯著的差別是數據量。前兩項技術，每個孔中產生了 1到2個數值，而在熒光壽命檢測模式中，原初數據是一條至少2000個點構成的曲線，反應了樣品的復雜化學狀態。在熒光強度檢測中，只能得到簡單的一個值-RFU，在熒光偏振檢測模式中，則是兩個值的均一化結果。
4．熒光壽命產生的"信號"對應的就是曲線的形狀
那么如何描述一個衰減曲線的形狀呢？這要依據曲線本身。特征越少，越容易描述。對一條曲線的描述的目的首先是從中獲得一個能夠反應樣品化學狀態的數值，其二是通過對分子物態的實時觀察得到關于樣品的盡可能多的信息。一條單階的衰減曲線的形狀很容易用一個單一的參數定義，該參數即為單階的時間壽命。而在一個復對數的曲線上，時間壽命則等同于曲線斜率的導數。
對于具有不同的時間壽命的物質所構成的一個樣品所衍生的衰減曲線，則需要更復雜的描述。
描述二階模式的二階衰減曲線的一個方法，是產生四個參數，兩個時間壽命 (τ 1 ，τ 2 )和對應的兩個振幅（α 1 ，α 2 ）（見圖3）。只有將四個參數綜合后，才能比較準確的定義曲線的形狀。因此，通過這四個參數，利用公式< τ > = (α 1 τ 1 τ 1 + α 2 τ 2 τ 2 ) / (α 1 τ 1 + α 2 τ 2 ) 可以得到一個值，將其定義為平均時間壽命。平均時間壽命類似用單階曲線歸一化相同數據得到的熒光壽命的值。
例如，兩個發色團的混合物，每一個都有自己特有的時間壽命。既然這樣，就假定時間壽命τ 1 ， τ 2 已知，那么相對振幅 α 1 /( α 1 + α 2 ) 和 α 2 / ( α 1 + α 2 ) 就分別等同于兩種標記物的量。顯而易見，在分析檢測中，就信號本身而言，包含的信息很少，將這些信號歸類后，就可以用以監測復雜的化學反應。
在熒光強度檢測（ FI）模式中，熒光信號會隨著酶與底物的反應量而改變。在熒光偏振檢測中，信號的改變主要是由于分子的大小變化導致的，例如，由于受體和配體結合反應。
而對于熒光壽命檢測，衰減曲線的形狀則是隨著標記物的微環境的變化發生改變。在熒光壽命檢測分析技術的發展中，為了監測曲線的形狀，需獲得一個參數范圍。這個信號或許是個單階熒光壽命曲線，或許等同于二階曲線得到的時間壽命的一階值，也可能是反應復合物變化的相對振幅或者是平均時間壽命的值。
除了亦今所能描述的單一信息，從每一條衰減曲線中，可以計算一個綜合的數值，該值與在標準的熒光強度測量模式中獲得的熒光強度成正比。將這個綜合參數與時間壽命分解后的參數組合，將得以能夠提供一個樣品全部有用的信息。
5. 結論
藥物篩選的趨勢是朝著獲得高質量的數據方面發展的，而數據的質量主要指的是它的可靠性，重復性，以及靈敏性。而且，需要將每個孔的多個相關參數組合，這稱作高通量篩選。
熒光壽命是一項新的技術，利用它使得研究和篩選工作有望達到高通量的目標。通過直接檢測感興趣的化學反應中微環境的變化，得到的信號要高于通常檢測中信號干擾。
一個熒光壽命檢測中得到的原始數據使得能夠同時瞬間分析樣品的狀態。例如，將平均時間壽命和熒光強度值組合處理，將為一些量控信息提供可靠的數據保證。因此，已將熒光壽命時間分辨技術當作一個高通亮篩選的方法。
從技術角度上說，這項新的技術需要借助具有 TCSPC分析能力的儀器。Tecan Ultran Evolution with FLT 會提供給使用者一個友好的界面來評測時間壽命。而真正準確的檢測到熒光壽命永遠是不容易的。