熒光定量PCR染料法介紹

     熒光定量PCR儀負責監控反應體系中熒光強度的變化，記錄檢測熒光達到閾值時的循環數。從理論上說，每一個qPCR循環會使目標序列翻倍，因此人們可以在Ct值的基礎上對樣本進行定量。

        熒光定量PCR主要分為染料法和探針法兩種。染料法一般采用DNA染料，這種方法不僅使用簡單，成本也zui低。不過染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA，不具有序列特異性。為此，一些廠商提供ROX作為內部熒光參考標準，用來校正背景。探針法與染料法的zui大區別在于，理論上探針法中的熒光信號只來源于目標序列。此外，人們還可以利用不同探針，在一個體系中同時檢測多種指標。

        成本低是染料法qPCR的一個主要優勢，DNA染料相對比較便宜，而且適用于任何序列。不過染料法無法在同一個樣本中檢測多個指標，也難以鑒定擴增得到的序列，會受到脫靶效應（如引物二聚體）的影響。在這種情況下，就需要進行熔解曲線分析，判斷擴增所得產物是否只有一種。熔解曲線分析能夠幫助研究者確定擴增的特異性。理論上利用熔解曲線也可以進行多染料的反應，甚至可以粗略定量那些峰值。

        探針法qPCR使用具有序列特異性的熒光寡核苷酸探針。目前zui常用的是TaqMan?探針，該探針5’端連有熒光基團，3’端連有淬滅基團。在反應進行時，探針與正反向引物之間的模板結合，當聚合酶到達探針處時，酶的5’-3’外切活性將熒光基團切下，使其脫離淬滅基團，發出熒光。