花生中黃曲霉素B1的檢測方法

      一、檢測目的：

1、熟練掌握薄層層析法原理。

2、掌握薄層層析操作作方法。

　　二、原理

　　樣品中黃曲霉毒素B1經有機溶劑提取，濃縮、凈化以及薄層分離前處理后，在波長365nm紫外光下產生蘭紫色熒光，根據其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。

　　三、試劑

　　1.三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮

　　2.正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃).

　　3.無水乙醚或乙醚經無水硫酸鈉脫水

　　4.苯――乙腈(98：2)混合溶液：量取98ml苯，加2ml乙腈，混勻。

　　5.甲醇――水(55：45)溶液：配制方法同上。

　　6.三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉

　　7.硅膠G，薄層色譜用。

　　8.AFTB1標準溶液的制備：用百萬分之一的微量分析天平精密稱取1～1.2mgAFTB1標準品，先加入2ml乙腈溶解后，再用苯稀釋至100ml。然后避光置于4℃冰箱中保存。最后進行AFTB1標準溶液濃度的測定。(此標準溶液濃度為10μg/ml)。

　　9.AFTB1標準使用液Ⅰ：精密吸取1ml10μg/ml標準溶液于10ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此溶液濃度為1μg/ml。

　　10.AFTB1標準使用液Ⅱ：精密吸取1.0ml1μg/mlAFTB1標準使用液Ⅰ于5ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度，搖勻。此溶液濃度為0.2μg/ml。

　　11.AFTB1標準使用液Ⅲ：精密吸取1.0mlAFTB1標準使用液Ⅱ于5ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度，搖勻。此溶液濃度為0.04μg/ml。

　　12.50/L次氯酸鈉溶液：取100g漂白精，加入500ml水，攪拌均勻。另將160g工業用碳酸鈉(Na2CO3·10H2O)溶于500ml溫水中，再將兩液混合，攪拌，澄清后，再過濾即可。

　　四、儀器和用具

　　1.小型粉碎機、樣篩、電動振蕩器

　　2.全玻璃濃縮器、電子恒溫水浴鍋、薄層板涂布器

　　3.玻璃板：5cm×20cm。

　　4.展開槽：內長25cm，寬6cm，高4cm。

　　5.紫外光燈：100～125W，帶有波長365nm濾光片

　　6.微量進樣器、蒸發器：50ml

　　五、操作步驟

　　1.樣品提取、凈化樣品去殼去皮粉碎后，稱取20g粉碎過篩樣品，置于250ml具塞錐形瓶中，加30ml正乙烷或石油醚和100ml甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，等下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶中。取20.0ml甲醇水溶液提取液(相當于4g樣品)置于另一個125ml分液漏斗中，加20mlCHCl3，振搖2min，靜置分層(如出現乳化則可滴加甲醇使其分層)，放出CHCl3層，經盛有約10g先用CHCl3濕潤的無水硫酸鈉的慢速定量濾紙過濾于50ml蒸發皿中，分液漏斗中再加5mlCHCl3重復振搖提取，CHCl3層一并濾于蒸發皿中，最后用少量CHCl3洗濾器，洗液并于蒸發皿中。將蒸發皿放在通風櫥內于65℃水浴上通風揮干，然后放在冰箱內冰卻2-3min后，準確加入1ml苯-乙腈混合液(或將CHCl3用濃縮蒸餾器減壓吹干蒸干，然后再準確加入1ml苯-乙腈混合液)。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合，如果有苯的結晶析出，則將蒸發皿取下，繼續溶解、混合，晶體則立即消失，再用此滴管吸取上清液轉移于2ml具塞試管中。

　　2.樣品的測定(單向展開法)

　　(1)薄層板的制備：稱取約3g硅膠G，加入相當于硅膠量2-3倍左右的水，用力研磨1-2min至成糊狀后立即倒入涂布器內，推成5×20cm，厚度約0.25mm的簿層板三塊。在空氣中干燥大約15min后，放入100℃烘箱內活化2h，取出在干燥器中保存。一般可保存2-3d，若放置時間較長，可再進行干燥活化后使用。

　　(2)點樣：將簿層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm處做一個基線，然后在基線上用微量注射器滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距約為1cm，點直徑約為3mm。要求在同一塊板上滴加點的大小應一致，可用吹風機冷風邊吹邊加。滴加的樣點如下：

　　第一點：10μl、0.04μg/mlAFTB1標準使用液。

　　第二點：20μl樣品溶液。

　　第三點：20μl樣液＋10μl0.04μg/mlAFTB1標準使用液。

　　第四點：20μl樣液＋10μl0.2μg/mlAFTB1標準使用液。

　　(3)展開與觀察：加入10ml無水乙醚于展開槽內，預展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內加入10ml丙酮：三氯甲烷(8：92)溶劑，展開10-12cm，取出在紫外光下觀察結果，方法如下：

　　①第一點滴加10μlAFTB1標準使用液，其中含AFTB10.04μg/ml(最低檢出量5μg/kg)。可作為檢驗薄層板好壞及色譜是否合適，能檢出最低檢出量。如果展開后此點無熒光，則說明薄層板或色譜條件存在問題。

　　②第三點和第四點上滴加了樣液和AFTB1標準液，可使樣液中的AFTB1熒光點和標液AFTB1熒光點重疊。加以認證。

　　第三點是用來檢驗最低檢出量在樣液中是否能正常呈現，如果第一點呈陽性，第三點呈陰性則說明樣品的提取存在問題，可能存在熒光猝滅劑，應重新提取。

　　第四點主要是起定位作用。AFTB1的Rf值約0.6。

　　③第二點起判斷作用。如果第二點(樣液)在AFTB1標準點的相應位置(Rf≈0.6)處呈陰性，而其它各點均呈陽性，則說明樣品中AFBT1的含量在5μg/kg(最低檢出量)以下，如果第二點在其相應位置上呈陽性，則需進行確證試驗。

　　(4)確證試驗：為了證明在薄層板上樣液呈現的熒光確系由AFTB1產生的，則在樣點上滴加三氟乙酸，產生AFTB1的衍生物，繼續展開后，此衍生物的Rf值約為0.1左右。方法如下：

　　依次在薄層板左邊滴加兩個點：

　　第一點：10μl 0.04μg/mlAFTB1標準使用液。

　　第二點：20μl樣液。

　　在以上兩點處各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，經反應5min后，用電吹風機吹熱風2min，熱風吹到薄層板上的溫度不得高于40℃，再于薄板右邊滴加以下兩點。

　　第三點：10μl0.04μg/mlAFTB1標準使用液。

　　第四點：20μl樣液。

　　同前展開后，在紫外光下觀察樣液是否產生與AFTB1標準點相同的衍生物。第三點和第四點，可作為樣液與標準衍生物的空白對照。

　　(5)稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點的熒光強度與AFTB1標準點(最低檢出量)的熒光強度一致，則表示樣品AFTB1含量在5μg/kg；如樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據其強度估計減少點樣量或將樣液稀釋后再點樣，直至樣液點的熒光強調與最低檢出量的熒光強度一致為止，滴加樣式如下：第一點：10μg/ml AFTB1標使液。

　　第二點：根據具體情況點10μl樣液。

　　第三點：根據具體情況點15μl樣液。

　　第四點：根據具體情況點20μl樣液。

　　(6)計算：

　　X=0.0004×　　　 　　　　(3-1)

　　式中：X——樣品中AFTB1的含量，μg/kg；

　　V1——稀釋前樣液的體積，ml；

　　V2 ——出現同樣最低熒光強度時滴加樣液的點樣量，μl；

　　D——樣液的總稀釋倍數；

　　m——稀釋前相當樣品的質量，g；

　　0.0004——AFTB1的最低檢出量，μg。

　　注意事項

　　1.本法的靈敏度較高，容易產生誤差。如薄層板制作不平整、不均勻，點樣的間距太小等都會產生誤差。

　　2.AFTB1標準儲備液應密封于具塞試管中，在4oc冰箱中避光保存。如果在保存期間體積明顯減少，應及時補充溶劑。使用前，應對其測定標準液的濃度。

　　3.AFT是一種劇毒和強致癌性物質，因此，在使用時特別注意其安全保護。如實驗時應佩戴口罩，配標液時應戴乳膠手套。如被標液污染時應及時用50g/L次氯酸鈉溶液浸泡消毒。實驗結束后應做好清洗消毒工作，對于剩余的AFT標液以及呈陽性樣液，應先用50g/L次氯酸鈉處理后方可倒在指定的地方。實驗所用玻璃器皿消毒后再進行清洗(用50g/L次氯酸那浸泡5min)。