一、目的：
學習聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點的原理及方法。
二、原理：
等電點聚焦（isoelectric focusing,
IEF）或簡稱電聚焦（electrofocusing），也曾稱等電點分離聚焦電泳等。它是60年代中期出現的技術，克服了一般電泳易擴散的缺點。近年來，等電點聚焦電泳又有了新的進展，可以分辨等電點只差0.001pH單位的生物分子。由于它的分辨力高、重復性好、樣品容量大、操作簡便、迅速，在生物化學、分類學、分子生物學及臨床醫學研究等諸方面，都得到廣泛應用。
等電點聚焦電泳產生pH
梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩沖液相互擴散，在混合區形成pH梯度，此為人工pH梯度。這種pH梯度不穩定，常用于制備電泳；另一種是利用載體兩性電解質在電場作用下形成自然pH梯度。本實驗就是利用載體兩性電解質形成的自然pH梯度進行蛋白質樣品等電焦聚電泳的。
理想的載體兩性電解質應該在其本身的等電點處有足夠的緩沖能力和良好的導電性，且分子量要小，組成與被分析樣品有所區別，對分析樣品無變性作用或發生化學反應。常用的載體兩性電解質是一系列脂肪族多氨基和多羧基類的混合物，即是一系列的異構物和同系物，分子量在300—1000之間，各組分的等電點(pI)既有差異又相接近，pI的范圍在2.5—11之間。合成載體兩性電解質的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反應如下：
R1
和R2為氫或帶有氨基的脂肪基。這一反應的特點是生成眾多的異構物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等電點的分布，取決于原材料的性質、比例和合成條件。目前常用的載體兩性電解質的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、
Serralyty（Serva公司），近來已有國產商品了。不同廠家合成的方法不同，電泳的條件也略有不同。目前，載體兩性電解質商品在使用時還存在一些問題，如樣品中的鹽濃度對pH梯度有影響等，但畢竟優點很多，仍然得到廣泛應用。
分析載體兩性電解質的結構可知，它既有酸性基團(—NH3+ )，也有堿性基團(—COO- )，既可接受分子，也可釋放質子：
它們在酸性條件下帶正電荷，在堿性條件下帶負電荷。當它們所帶的正負電荷相等時，其凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH值為該兩性電解質的等電點，以pI
表示。所以兩性電解質的等電點在數值上等于它呈電中性時溶液的pH值。等電點是反映兩性電解質在溶液中得失質子的能力，是它的物化性質。兩性電解質在溶液中的行為可以從兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質。如溶液是pH7，對pI=9的兩性電解質來說，是處于酸性環境，故帶正電荷；但對pI=3的兩性電解質來說，卻是處于堿性環境，故而帶負電荷。所以，不同pI的兩性電解質，在同一環境中帶有不同性質和數量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質又破壞了水的解離平衡：
使溶液pH有所改變。當某一兩性電解質pI較低，即釋放質子（H+）能力較強，使溶液pH值下降，這類兩性電解質稱為酸性兩性電解質；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質。所以，在溶液中的兩性電解質一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質；另一方面，它又影響周圍環境（水溶液），使其pH值有所改變。
載體兩性電解質是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分布在2.5—10之間。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負極是氫氧化鈉。正極是酸性環境，載體兩性電解質都帶正電荷，但由于pI的不同，其所帶正電荷數量就有所差異電泳時負極泳動的速度也就因此不同。同理，負極是堿性環境，載體兩性電解質帶有數量不等的負電荷，以不同速度向正極泳動。根據兩性電解質的特性，在泳動過程中又不斷地與溶液交換質子，改變了溶液的pH。當達到平衡時，即得失質子相等，不再出現質子的交換時，載體兩性電解質到達等電點并各處于自己的pI區域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈現不同的pH，隨載體兩性電解質的pI梯度而形成pH梯度。由于凝膠的防對流擴散作用，使pH梯度保持穩定不變（參看圖20-1）。實驗操作中，要求開始電泳時恒壓60V，15min，目的在于使小分子的，泳動快的載體兩性電解質可在短時間內形成一個粗略的pH梯度。此后，恒流為8mA，是為了避免電泳開始時介質中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。當各種蛋白質逐漸泳動到各自等電點位置時，帶電顆粒逐漸減少，出現電阻增大，電壓隨之增高現象。當電壓升到550V時，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恒壓到580V，繼續電泳120min后，蛋白質顆粒慢慢地集中到它等電點位置。電流接近于零時，蛋白質顆粒不再泳動，電泳也到此結束。蛋白質樣品也因其等電點的差異而得到集中和彼此分開（參看圖20-2）。
最早的等電聚焦電泳是垂直板式，后來發展為水平板式。超薄層水平板式也是近幾年發展起來的，這種形式的電泳的優點是節省兩性電解質試劑、加樣數量多、利于比較不同樣品的電泳結果，而且電泳后的固定、染色和干燥都很方便、迅速。水平板式等電聚焦電泳的最大優點是防止了由于電極液的電滲作用而引起pH梯度的漂變。
三、器材及試劑：
1．器材：
穩流穩壓電源，水冷式平板等電聚焦電泳電槽，玻璃板（11.5×11.5×0.2cm），大鐵文具夾，塑料模具（厚0.5mm，中間開孔9.0×9.0cm），小眼科剪子，鑷子，解剖刀，1ml注射器，50μl和100μl微量注射器，擦鏡紙，濾紙，精密pH試紙，凝血板，培養皿（120mm），脫脂棉，棕色試劑瓶，吸液管，吸耳球，玻璃紙，坐標紙。
2．試劑：
重蒸水，丙烯酰胺（重結晶），甲叉雙丙烯酰胺（重結晶），過硫酸銨，TEMED（四甲基乙二胺），載體兩性電解質（pH3.5—10），考馬氏亮藍R250，液體石臘，乙醇（95%），硅油，磺基水楊酸，三氯乙酸，甲醇，乙酸（36%），已知pI蛋白質樣品和標準等電聚焦樣品（市售），磷酸，氫氧化鈉。
3．溶液配制：
（1）單體貯液：丙烯酰胺2.91g，甲叉雙丙烯酰胺0.9g，重蒸水溶解，定容到100ml，過濾備用（在棕色瓶中4℃可保存兩周）。
（2）電極液：陽極1mol·L-1磷酸（H3PO4）：原磷酸試劑的濃度約為16mol·L-1，故配制時用重蒸水稀釋16倍即可。
陰極 1mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）：稱取4g固體溶于100ml重蒸水中。
（3）固定液：甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水楊酸3.5g加水定容到 100ml。
（4）染色液：乙醇35ml，冰乙酸10ml，考馬氏亮藍R2500.1g加水定容到100ml，溶解后過濾備用。
（5）脫色液：乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。
（6）保存液：甘油1—5ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到 100ml。
（7）樣品：牛血清蛋白 1mg·ml-1，糜蛋白酶元A 1mg·ml-1，肌紅蛋白 1mg·ml-1，卵清蛋白 1mg·ml-1，標準等電聚焦樣品。
（8）大鼠肌肉提取液：1g鼠肌肉，加水5ml，勻漿提取，離心取上清液透析備用。
（9）10%過硫酸銨：稱1g溶在10ml重蒸水中（純過硫酸銨溶解時會有響聲）。
四、操作步驟：
1．凝膠配制
單體貯液2.0ml，重蒸水5.3ml，載體兩性電解質0.6ml，真空抽氣 15min后加TEMED（原液）8μl和10%過硫酸銨60μl，混勻立即灌膠。
2．灌膠
（1）準備
● 取3mm洗凈晾干的玻璃板，涂上一層薄薄的防水硅油，以重蒸水沖洗，使硅油分布均勻。
● 平板電泳槽調水平，電泳槽上放上一張濾紙。
● 濾紙上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（參看圖20-3（a））。
● 用文具夾將模具和玻璃板固定在平板電泳槽上。
● 在模板上面，文具夾的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。
（2）灌膠：小心、迅速地將混勻的膠灌到模具的框內。灌膠時膠液沿著上面有硅油的玻璃板的一端即文具夾的另一端，向文具夾方向推進，邊灌膠邊推上面的玻璃板，使模具框內充滿膠液，框內不能有氣泡，為趕走氣泡可移動玻璃板，待氣泡釋放后再向前進，一直推到接觸文具夾，使兩塊玻璃把膠封在框內，模具框內充滿膠液，切不可有氣泡，否則要重新制膠和灌膠（參看圖20-3(b)）。
在正式灌膠之前調水平之后，以8ml水代替膠液練習灌膠，直到不產生氣泡為止。操作熟練后，洗凈玻璃板、模具、晾干備用。抽氣后再加TEMED和過硫酸銨，混勻后迅速灌膠。過硫酸銨溶液要新鮮，必須當天配制。
（3）去掉上面的玻璃板和模具：灌膠后室溫靜止1h，在模具和膠的邊緣可觀察到折光，這是膠已凝固的特征。再老化0.5h，然后小心將兩塊玻璃打開，凝膠和模具會自然地貼附在其中一塊玻璃板上，去掉上面的模具及凝膠板周圍的和滲出邊緣的殘膠，即可作加樣準備。