纈沙坦干預單側輸尿管結扎大鼠腎纖維化作用的實驗研究＊
趙燕云1 , 黃笑夏1 , 趙依娜1 , 劉張紅2 , 胡振奮2 , 董飛俠2(浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院 溫州 325000)
摘要:目的 探討纈沙坦(V
alsartan , Val)對單側輸尿管結扎(unilate ral ureteral obstruction ,
UUO)大鼠腎間質纖維化的影響及其藥學作用機制。方法 18 只 SD 大鼠制作 UUO 模型后隨機分為 3 組, 纈沙坦組給予纈沙坦灌胃治療,
假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃治療。 4 周后腹主動脈采血, 檢測血漿血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ , Ang Ⅱ), 取 U
UO 側腎組織, 行M asson 染色觀察腎小管間質病變, 免疫組織化學染色觀察 a-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle
actin , a-S M A)和轉化生長因子-β1(t ransforming grow th factor-beta 1 ,
TGF-β1)在腎小管間質的表達, 并運用圖像 分析系統進行半定量分析。 結果 纈沙坦可以顯著減少血漿 Ang Ⅱ的含量(P
<0.01), 下調 a-S M A 和 TG F-β1 的表達(P <0.01), 減輕腎間質纖維化的程度(P
<0.01)。 結論 纈沙坦可能通過阻斷 Ang Ⅱ的生成, 抑制 TG F-β 1、a-SM A 的表達, 從而達到抑制腎纖維化的作用。
關鍵詞:血管緊張素Ⅱ 受體拮抗劑;單側輸尿管梗阻;a-平滑肌肌動蛋白;轉化生長因子-β 1;腎間質纖維化
中圖分類號:R969 文獻標識碼:A 文章編號:1006-3765(2011)-12-0028-03
Effects of valsartan on renal interst it ium fibrosis with unilateral ureteral obstruction in rats
ZHAO Yan-Yun1 , HUANG Xiao-xia1 , ZHAO Y-i Na1 , LIU Zhang-Hong2 , HU Zhen-Fen2 , DONG Fei-Xia2(Department
of Pharmacy , Wenzhou Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine 325000 , Chi-
na)
ABSTRACT:OBJECTIVE
To explore the Valsartan on unilateral ureteral obstruction (unilate
ral ureteral ob- struction , U UO)in rat renal interstitial fibrosis ａnd
i ts pharmaceutical mechanism of action.METHODS 18 SD rats af ter U UO
model w ere randomly divided into sham operation group , model group ,
valsartan g roup , valsartan g roup w ere given valsartan gavage t
reatment , sham operatio n group , model g roup , no rmal saline gavage
thera- py.A f ter 4 w eeks , to acquire abdominal aortic blood to detect
plasma angio tensin Ⅱ , ａnd take U UO kidney tis- sue.Masso n staining
to detect tubulointerstitial lesions ａnd immunohistochemical staining of
alpha-smooth muscle actin (a-SMA)and t ransforming g row th facto
r-β1(T GF-β1)in the ex pression of tubulointerstitial , ａnd through
image analysis system to com plete semi-quant itative analy sis.RESULTS
Plasma Ang Ⅱ levels was reduced sig- nif icantly by Valsartan (P
<0.01), ａnd a-SMA ａnd TGF-β1 expression w as reduced (P <0.01),
the ex tent of re- nal interstitial f ibrosis w as reduced (P
<0.01).CONCLUSION Valsartan may be by blocking the formation of Ang Ⅱ
, inhibit TG F-β1 , a-SMA ex pressio n , so as to achieve suppression
of renal fibrosis.
KEY WORDS :Angiotensin Ⅱ receptor
antagonist;Unilateral ureteral obstructio n;Alpha-smoo th muscle actin
;T ransfo rming g rowth factor-beta 1;Renal interstitium fibrosis
纈沙坦(Valsar tan)不但具有穩定的降壓作用, 而且在改善腎小管間質損傷上具有一定的效果。 纈沙坦能否影響
TGF-β1 信號傳導途徑的表達, 進而影響腎間質纖維化的發生、發展。 該研究利用單側輸尿管結扎(U UO)模型探討血管
作者簡介:趙燕云, 女(1973 -)。 主管藥劑師, 主要從事臨床藥學以及實驗研究。
通訊作者:董飛俠, 男(1971 -)。 副主任中醫師, 醫學博士, 美國貝勒醫學院腎臟系高級訪問學者, 主要從事慢性腎臟疾病的理論以及臨床研究。聯系電話:13587638576 , E-mail :cgrsfht d @163.com
注:a.該研究包括作者署名無潛在利益沖突, 無經濟利益以及其他利益沖突。 b.1.藥劑科 2.腎內科
＊溫州市衛生局科學基金項目資助,
項目編號:2009A 012 ;溫州市衛生局科研項目資助, 項目編號:2010A 012 ;溫州市科技局科學基金資助,
項目編號:Y20100222 ;浙江省 151 人才專項科研基金, 溫州市 551 人才專項科研基金資助。
Strait Pharmaceutical Journal Vol 23 No.12 2011
緊張素Ⅱ 1 型受體拮抗劑對小鼠腎臟的保護作用機制。
1材料與方法
1.1實驗動物 清潔級雄性 SD 大鼠 18 只, 體重 180±20g , 在溫州醫學院實驗動物中心飼養, 人工光照, 陰暗各 12h, 自由飲食。 動物許可證號:SYXK(浙)2005-0061 。
1.2實驗藥物與試劑
纈沙坦膠囊(北京諾華制藥公司, 藥準字 H20040217);Ang Ⅱ 放免試劑盒(上海勁馬生物科技有限公司);鼠抗人 TG F-β1
、a-SM A 單克隆抗體;山羊抗鼠 IgG抗體(美國 SAN TA CRUZ 公司);免疫組化檢測試劑盒、DA
B顯色劑(武漢博士得生物科技公司)。
1.3造模與分組 模型制作:用 3 戊巴比妥鈉按 0.15mL· kg -1 的劑量麻醉大鼠后,
行左側輸尿管結扎術。 步驟:背部肋脊角處做一縱行切口, 長約 2～ 3cm(與背部正中線平行), 夾住脂肪組織 , 取出腎臟, 將其翻向脊柱側,
以生理鹽水紗布覆
2
結果
M asson 染色顯示假手術組腎臟未見明顯病變(見圖 1A , 表 1);U UO
術后第二十八天, 梗阻側腎組織腎小管間質大部分已纖維化(見圖 1B, 表 1), U U O 組與假手術組比較有非常顯著統計學意義 P
<0.01 ;纈沙坦組部分近端小管上皮細胞空泡變性, 管腔內可見脫落壞死的上皮細胞, 遠端腎小管擴張。 但是纖維化程度較 U UO
組輕(見圖 1C , 表 1), 二者比較有非常顯著統計學意義 P <0.01 。免疫組化顯示假手術組大鼠腎間質只有極少量的 T
GF-β1 、α-SM A 陽性表達(見圖 1D 、圖 1G , 表 1), 模型組大鼠 TG F-β1 、α-SMA
陽性表達與假手術組比較顯著增多(見圖 1E、圖 1H , 表 1)(P <0.01);纈沙坦組 TGF-β1 、α-SM A
陽性表達也較模型組明顯減少(見圖 1F 、圖 1I , 表 1)(P <0.01)。
表 1 3 組病理 M ASSON 染色以及Ang Ⅱ 、TG F-β1 和α-SM A 比較
蓋, 暴露腎蒂, 分離出輸尿管, 12 只在中 2/ 3 與下 1/ 3 處, 用 0
號線上下結扎兩次, 中間剪斷輸尿管。 提起切口處皮膚肌肉,
組別 纖維化指數
Ang Ⅱ (ng·L -1)
α-SM A
(陽性 )
TG F-β 1
(陽性 )
使腎臟回納原位, 分層縫合肌肉、皮膚層, 隨機分為模型組予以生理鹽水 1 日 1mL 灌胃;纈沙坦組為成人單位劑量的 10倍(給藥量為 12mg/ (K g·d) ;假手術組 6 只:剖開大鼠腹腔,分離出左側輸尿管后, 不結扎, 分層縫合, 予以生理鹽水 1 日1mL 灌胃。 療程 1 個月。
1.4指標檢測
在 U U O 術后治療 4 周, 處死全部大鼠, 腹主動脈采血分離血漿,-80℃冰箱保存。 采用放射免疫分析法測定血漿 Ang Ⅱ 水平,
取凍存全部血漿標本, 嚴格按照上海勁馬生物科技有限公司 Ang Ⅱ 放免試劑盒說明書冰浴下檢測血漿Ang Ⅱ 水平。 所有標本均同批檢測。
取術側腎組織置于10 福爾馬林固定液中, 石蠟包埋切片, 行 M asson 染色觀察腎小管間質病變, 免疫組化染色觀察 a-SM A 及 T
GF-β1 在腎間質的表達, 并應用圖像分析系統進行半定量分析。
1.5病理觀察 腎組織 M asson 染色, 光鏡觀察。 在 PAS- 9000 高清晰度數碼顯微圖像分析系統下計算腎小管間質纖維化指數。 高倍鏡(×200)下隨機選取 6 個不重疊視野測定小管間質纖維化面積與同視野小管間質總面積的百分比, 進
行半定量評分。評分標準:0 分:無病變;1 分:<25 ;2 分: 26 ～ 50 ;3 分:>50 。 每張切片取 6 個視野的平均積分, 再在各組取平均值。
1.6免疫組織化學檢測
免疫組化 T GF-β1 、a-SM A 采用 A BC 法:石 蠟切片脫蠟, 水化后, 用 0.075 胰酶于 37 ℃, 15min
或采用微波進行抗原修復, 一抗工作濃度為 1∶600 ～ 1000。 應用 DAB(二氨基聯苯胺)顯色。 常規脫水、透明、中性樹膠封片, 鏡檢,
在 400 倍光鏡下觀察、記錄免疫組化結果, 棕黃色為陽性染色。 在每張切片不包含腎小球和血管的間質區域隨機選取 20
個高倍鏡視野(X200, HPF), 用 Niko n E- clipse 80i Nis-Elements image softmare
分析系統對所選取視野中免疫組化陽性信號進行圖像分析 , 計算每個視野中陽性染色面積占總視野面積的百分比。
1.7統計方法 實驗數據以(x ±s)表示, 多組間比較采用單因素方差分析(one-w ay ANO VA), 所有統計學處理均由 SPSS 16.0 軟件完成, P <0.05 為有統計學意義。
假手術組
0.23 ±0.06 453.6 ±63.83 10.16 ±1.28 10.18 ±1.39模型組 3.69 ±0.39 ＊ 1385.3
±91.48 ＊ 68.39 ±5.53 ＊ 65.66 ±6.87 ＊纈沙坦組 1.52 ±0.37 # 856.4 ±75.56 #
30.15 ±3.98 # 30.54 ±5.69 #
注:與假手術比較＊P <0.01 ;與模型組比較#P <0.01 。
3討論
3.1腎素-血管緊張素系統(renin-angio
tensin system , RAS)被激活是導致腎纖維化的主要因素。 Ang Ⅱ 是這一系統中造成腎臟損害的主要物質,
參與調節血壓、腎小球濾過與腎小管重吸收, 同時能夠促進細胞外基質的積聚, 腎小管間質纖維化時, 系膜細胞合成增多, 進而腎臟局部的 Ang Ⅱ
活性增高, 通過直接或間接誘導 TG F-β1 的表達, 刺激腎臟局部單核細胞
趨化蛋白-1(mono cy te chemoattractant protein, M CP-1)和 Ⅰ 型
-纖溶酶原激活物抑制劑(plasminog
en activator inhibitor , PA I- 1)的表達, 促進腎小管間質成纖維細胞的增殖、分化,
導致大量單核巨噬細胞浸潤腎小球, 細胞外基質成分合成增多, 降解減少, 顯示 RAS 在腎小管間質纖維化發病機制中發揮著舉足輕重的作用, U
UO 造成的大鼠腎間質纖維化很可能是由 Ang Ⅱ 在腎組織的生成增多所致, Ang Ⅱ 拮抗劑能明顯降低 TGF- β1 mRNA 和Ⅳ型膠原
m RN A 的表達〔1 ～ 5〕。 還有有研究證實抑制 RAS 的藥物如血管緊張素轉換酶抑制劑(angio
tensin...........想要閱讀全文，歡迎聯系我司業務員領取哦！