細菌的革蘭氏染色和特殊形態觀察

革蘭染色法是細菌學中最廣泛使用的一種鑒別染色法。1884 年 由丹麥醫師 Gram 創立。近年來由于對細菌細胞壁的結構有了較深入的了解，對革蘭染色的機制提出不同的看法。一般認為革蘭陽性細菌的肽聚糖層較厚，經乙醇處理后使之發生脫水作用而使孔徑縮小，結晶紫與碘的復合物保留在細胞內而不被脫色；而革蘭陰性細菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經乙醇處理后部份細胞壁可能被溶解并改變其組織狀態，細胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結晶紫與碘的復合物洗去而被脫色。雖然如此，革蘭染色的差異并不能完全認為是化學的差別，也因物理結構不同結果不同，例如酵母菌細胞壁的成份完全和細菌不同，但具有革蘭染色陽性反應。

方法是先將細菌用結晶紫染色，加媒染劑（增加染料和 細胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復染劑染色。如果細菌 不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復染液的顏 色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類：革蘭 陽性菌和革蘭陰性菌。
單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構造等。

復染色法：用兩種或兩種以上染色液進行染色，有協助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理： 現在認為細菌對革蘭染色的不同反應主要是革蘭陽性菌和陰性菌 的細胞壁結構與化學組成不同。革蘭陽性菌的細胞壁較厚，肽聚糖含量多，且交 聯度大，脂類含量少，經 95％乙醇脫色時，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低， 與細胞結合的結晶紫與碘的復合物不易被脫掉，因此細胞仍保留初染時的顏色。 而革蘭陰性菌的細胞壁較薄，含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少，乙醇脫 色時溶解外層類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易 于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染的顏色。

實驗試劑

革蘭氏染色液一套 
結晶紫
碘液
95%乙醇
番紅花紅
孔雀綠

實驗設備

顯微鏡
蓋玻片
載玻片

實驗步驟

1. 革蘭氏染色
（1）涂片

（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。

（3）媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。

（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。

（5）復染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。

（6）鏡檢：觀察染色結果并繪圖。

2. 染色過程：涂片（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（結晶 染色過程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脫色（1min）→復染（番紅花 紅染色 1min）→干燥→鏡檢（油鏡）

3. 油鏡的使用與保養

（1）在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉動油鏡，在轉 換油鏡時，從側面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而 又不以壓破載玻片為宜。

（2）用雙眼觀察目鏡，并慢慢轉動粗調節器至出現模糊物象，然后用細 調節器至物象清晰為止。

（3）如果不出現物象或者目標不理想要重找。

（4）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許乙醇將鏡頭上和標本上的香柏油 擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。

影響因素

操作因素

1、涂片太厚 在涂片時細菌挑的太多，沒法分開，在脫色時就不能將第一步染上的結晶紫的顏色脫去，可能會使革蘭陰性菌也出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。 　　

2、脫色時間 陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時間條件下的結果，如果延長脫色時間，也會使脫色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脫去顏色，最后染上復紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時間太短的話又會使陰性菌染上的結晶紫不能完全脫色，出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。 　　

3、固定方法 固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態結構。固定方法是將干燥后的細菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的同學將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發生變化。影響了染色的結果。

細菌因素

1、細菌培養時間 細菌的典型形態、染色性是在對數生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。 　　

2、培養基的成分 一般認為革蘭陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的復合物結合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。

染液因素

1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。 　　

2、結晶紫 結晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。 　　

3、酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當酒精的濃度為70% 時，它的脫色能力最強，可能使革蘭陽性菌染上的結晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。