| 實驗步驟 | 操作程序
第 1 天
今天的目的是試驗 T7 RNA 聚合酶表達的誘導條件，確定其在上清/沉淀中的分布情況，并為第二天的分離純化步驟作出初步評估。
1) 取一份 50-ml 經低密度培養過夜的大腸桿菌細胞培養物，開始工作。
2) 于 A600nm 為 0.3~0.7 時，用 0.8 mmol/L IPTG 誘導 T7 RNA 聚合酶表達，將培養物分成兩份。
3)30 min 后，對一份培養物加利福平至終濃度為 150pg/ml。
4) 誘導過程中，于各時間點取樣作 SDSPAGE 分析：取 1 ml 培養物離心后，按每單位 A600nm 加 100ul 的 2xSDS 樣品緩沖液溶解沉淀，踉蹤誘導時間 2~4 h。
5) 取完最后一個樣品，合并培養物，用超聲處理/DOC 法（見 P.146) 破碎細胞，此時應能回答該蛋白是可溶的還是在沉淀中的這個問題。
6) 若該蛋白存在于沉淀，可初步用 SKL 溶解法（見 pp.148~149 和 p.173) 篩査。若該蛋白存在于上清，則可試著篩選上清的 PEI 沉淀/洗脫條件（見 PP.153~154 和 pp.l74~175)。完成這些實驗后，把所有東西扔進廢物箱，并為第 2 天
制備更大量（1L) 的培養物。
第 2 天
今天的目的是快速通過蛋白質純化方案的前幾步操作，篩選后面幾步柱層析操作請用按第 1 天確定的最佳條件新鮮制備的 1 升培養物。
1) 若蛋白質在可溶性組分中，可用 PEI 沉淀/洗脫法 (PP.153~154) 處理，然后篩選它與不同層析介質的結合條件。一般，建議先試離子交換劑（Q 和/或 S) 和疏水作用介質（苯基-Sepharose)。先篩選結合條件，然后再篩選最佳結合條件下的洗脫條件。蛋白以分批方式（batch mode) 吸附于層析介質后，再裝柱、洗脫。
2) 若蛋白在沉淀組分中，則可分成數份，以原先規定的 SKL 水平按幾種蛋白濃度進行溶解。透析過夜。亦可試著用鹽酸胍（GuHCl) 或尿素對幾份沉淀進行折疊實驗。若沉淀不像所希望的那樣純，可試著用其他去垢劑（如 Triton X-100,Tween-20,Brij-35) 或低濃度的尿素、鹽酸胍洗滌沉淀。待到明天，用凝膠過濾色譜法分析確定單體蛋白量與蛋白濃度及其他參數的函數關系。再制備 1 升以上的培養物。
第 3 天
今天的目的是通過蛋白質的主要純化步驟，并進一步試驗層析步驟。開始測活試驗，并用雙向凝膠電泳尋找電泳異形體（electrophoretic isoform) 和/或共遷移的雜質。
1) 若蛋白質是可溶的，則應有相當純的物料，這時大概是稽奄可溶性聚集體和修飾蛋白（modified protein) 和試著進行活性測定的時候了。
2) 若蛋白質在沉淀中，可能還必須用某種層析方法以除去殘留的去污劑。 展開 |
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