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  • 發布時間:2019-03-26 17:40 原文鏈接: 細菌中制備基因組DNA實驗——小量制備

    真核生物的一切有核細胞(包括培養細胞)都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內,因此,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。


    實驗方法原理提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質,再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質,得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
    實驗材料

    細菌

    試劑、試劑盒

    TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇CTAB

    儀器、耗材

    離心機搖床

    實驗步驟

    1.  培養5 ml 的細菌培養物至飽和狀態,取1.5 ml 的培養物離心2 min。

    2.  沉淀物加入567 ul 的TE緩沖液,用吸管反復吹打使之重懸。

    3.  加入30 ul 10%的SDS和3 ℃ 20 mg/ml蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1 h。

     

    4.  加入100 ul 5 mol/l NaCl充分混勻,再加入80 ul CTAB/NaCl溶液,混勻,于65℃溫育10 min。

     

    5.  加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,離心4~5 min將上清液轉人一個新管中,如果難以移出上清,先用牙簽除去界面物質。

     

    6.  加入等體積的酚/氯仿/異戊醇,混勻,離心5 min,將上清液轉入一只新管中。

     

    7.  加入0.6體積異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,用一個封口的巴斯德管將沉淀轉移至1 ml 的70%乙醇中洗滌。

     

    8.  離心5 min,棄上清,用凍干機稍加干燥,重溶于的下100 ul  TE緩沖液,每次酶切反應用10~15 &mu;l。


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