一、凍存技術不良或細胞生活力弱時可降低接種存活率
為獲得確切的接種存活率,接種時一定要接種分散為單細胞懸液。一般情況下把細胞直接接種在碟皿中即可。細胞接種密度和克隆形成率有一定關系。做克隆率測定時,一般持續一周,期間隨時檢查,到細胞形成克隆時終止培養,固定染色。 1. 細胞
80 %~90 %匯合細胞;
2. 懸液制備
用消化法制備成單細胞懸液,接種到適宜底物(玻璃或塑料瓶皿);用多孔塑料板亦可(每孔底面積不宜小于1mm2);
3. 培養
置溫箱中培養;
4. 觀察
隔48~96 小時,見細胞克隆已形成,終止培養;1:3 醋酸甲醇固定、Giemsa染色、鏡下觀察、計算克隆數。
二、軟瓊脂培養
特別是雙層軟瓊脂培養,仍為當前檢測轉化細胞和腫瘤細胞最為常用的方法,與細胞惡性程度有很大的符合率。 1. 瓊脂制備
用三蒸餾水分別制備出1.2 %和0.7 %兩個濃度的低溶點瓊脂糖液,高壓滅菌后,維持在40 ℃中勿令凝固;
2. 無菌制備出2xDME(含有2x抗生康和20%的小牛血清),保存在37 ℃中;
3. 底層瓊脂制備
按1:1混合1.2 %的瓊脂糖和2×DME后,取3 ml 混合液注入直徑6 cm平皿中(如為10 cm平皿則加7~10 ml),令冷卻凝固、置CO2溫箱中備用;
4. 消化細胞
用營養液制成細胞懸液、計數;
5. 頂層瓊脂制備
按1:1 比例讓0.7 %瓊脂和2xDME在無菌試管中相混以后,再向管中加入0.2 ml的細胞懸液,充分混均、注入已鋪有1.2 %瓊脂糖底層平皿中(直徑6 cm 平皿加3 ml;10 cm平皿加7~10 ml),遂形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后,置入37 ℃CO2溫箱中,培養10 天~14 天;
6. 觀察細胞集落。 展開 |