箝位勻強電場的脈沖場凝膠電泳

DNA 大小標準目的基因組 DNA

變性緩沖液凝膠電泳緩沖液

優質瓊脂糖CHEF 凝膠設備循環水浴水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

變性緩沖液（0.5 N NaOH，1.5 mol/L NaCI）

溴化乙錠（1 μg/ml）或適當稀釋度的 SYBR Gold

0.5X TBE 凝膠電泳緩沖液

2. 凝膠

優質瓊脂糖

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 大小標準

目的基因組 DNA

4. 專用設備

CHEF 凝膠設備

循環水浴

14℃ 水浴

二、方法

CHEF 分離 DNA 片段

1. 用 0.5 X TBE 緩沖液配制適當濃度的瓊脂糖凝膠后灌鑄。用氣泡水平儀監測以保證托盤在實驗臺上完全水平。室溫下讓凝膠硬化 1 h。

2. 將膠置于 CHEF 設備中，加入足夠的 0.5X TBE 剛好沒過凝膠，剩余的緩沖液冷卻至 14℃。

3. 制備好含有目的 DNA 的瓊脂糖栓，進行限制酶消化。制備和包埋 DNA 大小標準品。

4. 輕輕地分別將栓放入微型離心管中，每管中加入 200 μl 0.5 x TBE, 室溫溫育 15 min。

5. 經過消化和洗滌的 DNA 栓分別包埋在凝膠加樣孔中，利用熔化的制膠瓊脂糖封住凝膠栓。

6. 讓封栓的凝膠硬化約 5 min, 加入額外的 0.5X TBE 緩沖液（先前步驟 2 冷卻至 14℃ 的）完全蓋住膠。

7. 啟動緩沖液循環，電力供應條件電泳。

8. 電泳結束后，室溫下，溴化乙錠或適當稀釋度的 SYBR Gold 室溫染色 30 min。水中脫色 30 min, 紫外燈下照相。

DNA 變性轉移到尼龍膜

9. 照相后，凝膠于 250 ml 變性緩沖液中輕微振搖溫育 30 min。更換變性緩沖液后再溫育 30 min。

10. 在變性緩沖液中利用毛細管印跡直接將 DNA 轉移到尼龍膜上。

11. 轉移后，80℃, 2 h 烘烤或紫外交聯或微波處理將 DNA 固定在尼龍膜上。

12. 在含有甲酰胺的緩沖液中用標記探針進行預雜交和雜交。