等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定、連續和線性的pH梯度中進行分離。按pH梯度的形成原理不同可分為載體兩性電解質pH梯度等電聚焦電泳和固相pH梯度等電聚焦電泳。
一、載體兩性電解質pH梯度等電聚焦電泳：
1、理想的載體兩性電解質應具備的條件：
載體兩性電解質是兩性分子，使其在電泳柱中能達到一個平衡位置。載體兩性電解質可作為載體，但兩性電解質不能用于等電聚焦。只有載體兩性電解質，即具有好的導電和緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。
（1）易溶于水，在pI處應有足夠的緩沖能力，形成穩定的pH梯度，不致被蛋白質或其它兩性電解質改變pH梯度。
（2）在pI處應有良好的電導和相同的電導系數，以保持均勻的電場。
（3）分子量小，易與被分離物分開。
（4）化學性能穩定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化學組成不同于蛋白質。
2、蛋白質的等電點（pI）：
蛋白質最主要的特性是它的帶電行為，在不同的pH環境中帶不同數量的正電或負電，只是在某一pH時，蛋白質的凈電荷為零，此pH即為該蛋白質的等電點（pI）。蛋白質的等電點取決于它的氨基酸組成和構象，是一個物理化學常數。
3、載體兩性電解質pH梯度的載體：
常用載體是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。
4、載體兩性電解質pH梯度的介質：
一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的緩沖液。
5、載體兩性電解質pH梯度的形成：
等電聚焦電泳的關鍵是pH梯度的形成，載體兩性電解質pH梯度的介質是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后自然形成pH梯度。
在沒有電場時，載體兩性電解質的pH值約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質分子都荷電。
當引入電場時，載體兩性電解質分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷負電zui多）將zui快地向陽極移動，當它達到凈電荷為零的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的載體兩性電解質（荷負電次多）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到零時才停止。同樣，其周圍環境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質分子用增加pI級數的方法將分別在陽極和陰極之間到達自己的位置，從而形成pH梯度。
6、工作原理：
蛋白質的等電點取決于其氨基酸的組成。組成每一種蛋白質、多肽的氨基酸的數目和比例不同，蛋白質的等電點范圍很寬。在電泳儀中加入載體兩性電解質，通直流電時，載體兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度。蛋白質進入時，不同的蛋白質移動到與其等電點相當的pH位置上，從而使不同等電點的蛋白質得以分離。
7、特點：
（1）優點：
1）屬于非變性蛋白質分離技術。
2）分辨率高，區帶清晰且窄，分辨率至少可達0.01 pH單位。
3）受溶質擴散影響小，可消除分子擴散引起的分離度下降。
4）加樣部位自由，重現性好。
5）操作簡單，電泳速度快。
6）可測定蛋白質和多肽的等電點。
7）分離在較低的工作電壓下（20V/cm）進行，可避免蛋白質上專一結合（以共價鍵等強作用力結合，一定程度上依賴于蛋白質構象）的金屬在電場作用下丟失。這部分金屬大多構成蛋白質的活性中心或結構中心，比非專一結合金屬具有更重要的生物學意義。
（2）缺點：
1）載體兩性電解質合成過程復雜，影響蛋白質點的位置，從而影響重復性。
2）凝膠灌制重復性差，影響結果重復性。
3）負極漂移現象使pH梯度不穩定。
4）負極漂移現象使堿性蛋白質無法聚焦。
5）需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發生變性的蛋白質。
6）載體兩性電解質的加入對產品產生污染。
7）操作過程中易發生凝膠脫水起皺現象。