一、真菌DNA的提取(方法一)
1.實驗試劑
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)異丙醇
(7)無水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.實驗步驟
(1)取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振蕩混勻
(3)加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3～5min(此處是粗提沒有加酚,可以節約成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃離心5min)
(6)取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
(7)用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃處理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,風干,溶于200ul TE中,-20℃保存備用
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30 min
6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃處理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,風干,溶于200ul TE中,-20℃保存備用
DNA提取緩沖液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小異.主要是DNA提取液配方不一樣!成本也不一樣!