• <table id="caaaa"><source id="caaaa"></source></table>
  • <td id="caaaa"><rt id="caaaa"></rt></td>
  • <table id="caaaa"></table><noscript id="caaaa"><kbd id="caaaa"></kbd></noscript>
    <td id="caaaa"><option id="caaaa"></option></td>
  • <noscript id="caaaa"></noscript>
  • <td id="caaaa"><option id="caaaa"></option></td>
    <td id="caaaa"></td>
  • 發布時間:2019-09-12 15:44 原文鏈接: 電轉化流程

               

    實驗方法原理

    胞電轉染(電轉),也叫細胞電穿孔 (electroporation),是把外源大分子物質DNA、RNA、siRNA、蛋白質等以及一些小分子導入細胞膜內部的重要方法。


     在瞬間強大電場的作用下,溶液中細胞的細胞膜具有了一定的通透性,帶電的外源物質以類似電泳的方式進入細胞膜。由于細胞膜磷脂雙分子層的電阻很大,細胞外部電流場產生的細胞兩極電壓都被細胞膜承受,細胞質內分到的電壓可以忽略不計,細胞質內部幾乎沒有電流,因此也決定了正常范圍內的電轉過程中細胞毒性很小。電場使DNA等物質進入細胞膜后只能停止在細胞膜附近,隨后細胞本身的機制可以允許這些物質到細胞核等處。


     普通電轉能量過高可導致部分細胞因膜破壞而死亡,其中能存活下來的細胞內部都不會受到電流影響,因為細胞膜完整是細胞存活的必要條件。


     由于電轉技術依靠的是物理方法,細胞表面的分子特性對電轉影響比較小。相比化學轉染方法和病毒載體轉染方法,電轉可以用在所有的細胞種類上,而且容易定量控制。

    實驗材料

    單克隆菌落

    試劑、試劑盒

    LB液體培養基 ddH2O 甘油 NaAC 無水乙醇 70%乙醇

    儀器、耗材

    離心杯 離心機 低溫冰箱 離心管 電轉儀 電極杯

    實驗步驟

    一、電轉化感受態細胞的制備


    1.用槍頭挑取單克隆菌落,投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。(同時做培養基和槍頭的空白對照)


    2.37℃,220rpm,培養14-16個小時。


    3.第二天,以1:100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中,37度,220rpm,振搖2-3小時,每半小時測一次OD,當OD值達到0.3-0.4時,停止培養。


    4.將菌液在冰上預冷30分鐘,隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中,4℃,2500rpm離心10分鐘。


    5.棄上清,離心杯中加入少量ddH2O,使沉淀懸浮后,再將水注滿離心杯,4℃,4000rpm離心10分鐘。


    6.棄上清,加少量滅菌水,重懸菌體,再將水注滿離心杯,4000rpm,4℃,離心10min。


    7.棄上清,往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌,預冷),重懸菌體,再加滿10%甘油,  4℃, 4000rpm, 離心10min。


    8.棄上清,每個離心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀懸浮后,將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中,-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態加0.01ng puc18直接電穿孔轉化,檢測轉化效率。


    9.  次日觀察轉化子生長情況,并記錄。


    二、連接產物純化


    1.將連接產物轉移至一1.5ml Eppendorf管中,加入下列試劑:


    10μl  of  ddH2O


    2μl   of  3M NaAC(PH5.2)


    50μl  of  無水乙醇


    輕輕混勻,稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上;


    2.4℃,top Speed 離心30分鐘;


    3.小心移去上清,避免接觸到管底的沉淀物;


    4.加入500μl70%的乙醇,輕輕顛倒幾次洗滌沉淀(注:不要離心混勻);


    5.4℃,top Speed離心5分鐘;


    6.小心移去上清,將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇氣味;


    7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀,4℃短期保存,-20℃長期保存備用;


    三、電轉化


    1.從-80℃冰箱中取出感受態細胞,置于冰上解凍;


    2.取1 μl 純化后的質粒于一1.5ml的離心管中,將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預冷。


    3.將40~100ul解凍的感受態細胞轉移至此1.5ml 的離心管中,小心混勻,冰上放置10min。


    4.打開電轉儀,調至Manual,調節電壓為2.1KV。


    5.將此混合物轉移至已預冷的電極杯中,輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部;


    6.將電極杯推入電轉化儀,按一下pulse鍵,聽到蜂鳴聲后,向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養基,重懸細胞后,轉移到1.5ml的離心管中。


    7.37℃,220-250rpm復蘇1小時。


    8. 取20μl轉化產物加160μlSOC涂板,放于37℃溫室,過夜培養,次日查看轉化結果。其余菌液加1:1的30%的甘油后混勻-80℃保存。



    四、電擊杯清洗流程


    1.用清水將電擊杯稍沖一下。


    2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。


    3.棄去酒精,再用蒸餾水沖洗2~3遍,然后用1ml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯10遍以上。


    4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中,浸泡30分鐘。


    5.棄去無水乙醇,于通風廚內揮干乙醇。


    6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內待用。


                展開           
    注意事項

    1. 每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ,SOC 80μl,IPTG 20 μl。


    2. 不同樣品使用的電機杯應分開。


    3.每周用1%酒精浸泡30分鐘。


    其他

    1. 選擇合適的電場強度合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的最佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的最佳電場強度。


    2. 細胞的選擇用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.


    人体艺术视频