| 實驗方法原理 |
胞電轉染（電轉），也叫細胞電穿孔 (electroporation)，是把外源大分子物質DNA、RNA、siRNA、蛋白質等以及一些小分子導入細胞膜內部的重要方法。 在瞬間強大電場的作用下，溶液中細胞的細胞膜具有了一定的通透性，帶電的外源物質以類似電泳的方式進入細胞膜。由于細胞膜磷脂雙分子層的電阻很大，細胞外部電流場產生的細胞兩極電壓都被細胞膜承受，細胞質內分到的電壓可以忽略不計，細胞質內部幾乎沒有電流，因此也決定了正常范圍內的電轉過程中細胞毒性很小。電場使DNA等物質進入細胞膜后只能停止在細胞膜附近，隨后細胞本身的機制可以允許這些物質到細胞核等處。 普通電轉能量過高可導致部分細胞因膜破壞而死亡，其中能存活下來的細胞內部都不會受到電流影響，因為細胞膜完整是細胞存活的必要條件。 由于電轉技術依靠的是物理方法，細胞表面的分子特性對電轉影響比較小。相比化學轉染方法和病毒載體轉染方法，電轉可以用在所有的細胞種類上，而且容易定量控制。 |
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| 實驗材料 | 單克隆菌落 |
| 試劑、試劑盒 | LB液體培養基 ddH2O 甘油 NaAC 無水乙醇 70%乙醇 |
| 儀器、耗材 | 離心杯 離心機 低溫冰箱 離心管 電轉儀 電極杯 |
| 實驗步驟 |
一、電轉化感受態細胞的制備 1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照） 2.37℃，220rpm，培養14-16個小時。 3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養。 4.將菌液在冰上預冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。 5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃，4000rpm離心10分鐘。 6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4℃，離心10min。 7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，預冷)，重懸菌體，再加滿10%甘油, 4℃, 4000rpm, 離心10min。 8.棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中，-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態加0.01ng puc18直接電穿孔轉化，檢測轉化效率。 9. 次日觀察轉化子生長情況，并記錄。 二、連接產物純化 1．將連接產物轉移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑: 10μl of ddH2O 2μl of 3M NaAC（PH5.2） 50μl of 無水乙醇 輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上； 2.4℃，top Speed 離心30分鐘； 3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物； 4.加入500μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）； 5.4℃，top Speed離心5分鐘； 6.小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇氣味； 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃長期保存備用； 三、電轉化 1.從-80℃冰箱中取出感受態細胞，置于冰上解凍； 2.取1 μl 純化后的質粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預冷。 3.將40～100ul解凍的感受態細胞轉移至此1.5ml 的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。 4.打開電轉儀，調至Manual，調節電壓為2.1KV。 5.將此混合物轉移至已預冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部； 6.將電極杯推入電轉化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養基，重懸細胞后，轉移到1.5ml的離心管中。 7．37℃，220－250rpm復蘇1小時。 8. 取20μl轉化產物加160μlSOC涂板，放于37℃溫室，過夜培養，次日查看轉化結果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存。 四、電擊杯清洗流程 1.用清水將電擊杯稍沖一下。 2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。 3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯10遍以上。 4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。 5.棄去無水乙醇，于通風廚內揮干乙醇。 6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內待用。
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| 注意事項 |
1. 每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 2. 不同樣品使用的電機杯應分開。 3.每周用1%酒精浸泡30分鐘。
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| 其他 |
1. 選擇合適的電場強度合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要，電場強度不能過高，過高會增加細胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的最佳場強值，實驗前應測定所轉染細胞系的最佳電場強度。 2. 細胞的選擇用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞（15代以內，傳代后2d）。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛，表面結構致密比穩定期的細胞差，電轉后，細胞膜的恢復能力強，而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA. |