生物大分子的色譜純化方法

一、生物大分子色譜純化方法的選擇思路
通常在做純化前對自己的目標物質特性了解越多對純化將會越有利，如果不太了解，也可以通過電泳知道目標物質和雜質的情況，找到一種簡單的鑒定方法，此外在純化前必須先建立可靠的活性測定的方法。如果是未知的蛋白，那么通常可以有幾種簡單的摸索：
1. 凝膠過濾色譜。這個方法很常用，但是效率不高，對低濃度的樣品沒有富集作用，上樣量小。
2. 離子交換色譜。此法很常用，但是樣品必須沒有高濃度的鹽。
3. 疏水色譜。此法較好，它分離效率高，上樣量大，特別適合分離鹽析沉淀的樣品。
4. 親和色譜。是最有效的手段，關鍵了解目標物質的特性以便選擇合適的親和色譜填料。
二、主要用途介紹
1. 去除內毒素
內毒素也叫熱源，一般是磷脂 A ，糖類和蛋白，在中性條件下帶有負電荷。內毒素的磷脂部分有很強的疏水性，一般的在高鹽情況下它們會聚合，所以不能用疏水色譜，如果蛋白本身的疏水性強，可以選擇把目標蛋白結合到疏水色譜填料（苯基瓊脂糖凝膠 FF ，丁基瓊脂糖凝膠 FF ）上和內毒素分離。
內毒素因為帶有很強負電荷，如果目標蛋白帶陽電荷，用 DEAE 瓊脂糖凝膠 FF 或Q 瓊脂糖凝膠 FF 把內毒素吸附，達到去除內毒素的目的。如果目標蛋白帶陰電荷，可以嘗試用階段或梯度洗脫的方法把它們分離。
其中最有效而特異的方法是用親和色譜填料去除內毒素，為此專門開發了兩種專門去除內毒素的色譜填料，去內毒素瓊脂糖凝膠 FF 和高效去內毒素瓊脂糖凝膠 FF可以很方便去除內毒素，其應用簡單，效果明顯，樣品回收率高。方法是把適量的色譜填料加到樣品中 4 度震蕩 40h 左右無菌過濾就可以得到熱源符合要求的樣品，或者直接裝柱然后循環上樣 8 小時左右即可。
2. 去除核酸
大量的核酸會使樣品的粘度增加，影響傳質從而影響分離效果，此外在藥品檢驗中也對核酸的含量有嚴格的規定，所以去除核酸非常重要。
核酸帶有陰性的電荷，可用陰離子交換色譜填料 DEAE 瓊脂糖凝膠 FF 或 Q 瓊脂糖凝膠 FF 去除，也可用陽離子色譜填料： SP 瓊脂糖凝膠 FF 或 CM 瓊脂糖凝膠FF 直接把目標蛋白吸附而去除核酸。在 2M 硫酸銨的條件下， RNA 和 DNA 都可以被苯基瓊脂糖凝膠 FF 吸附。
此外也可以用核酸酶處理樣品，把核酸降解成小片段，用凝膠過濾就可以去除。此外也可以本公司的 DNA 純化瓊脂糖凝膠 FF 去除。
3. 純化硫酸銨沉淀樣品
硫酸銨沉淀是很常用的初分離的手段，這樣沉淀后的樣品可直接用苯基瓊脂糖凝膠FF 或者是丁基瓊脂糖凝膠 FF 分離，不用除鹽，非常方便。疏水色譜已經得到大規模的推廣和應用，是很好的純化的手段。此外疏水色譜也可以用于天然產物的分離純化，包括多肽、色素等各種物質的分離純化，它的分離原理和反相色譜相同，但是不同于硅膠色譜填料的是它對樣品幾乎沒有死吸附，所以回收率高。
4. 糖蛋白的純化
偶聯各種凝集素的瓊脂糖凝膠 FF 的親和色譜填料可以分離各種糖蛋白，例如 Con A 瓊脂糖凝膠 FF 可以純化糖基化的蛋白，或者膜組分，甚至細胞等物質。此外硼酸瓊脂糖凝膠 FF 也用來分離各種多糖和糖蛋白，其原理是苯硼酸類似于凝集素可以和各種糖基上的鄰二羥基發生親和作用。
5. 膜蛋白分離
有比較強的疏水性，可以用苯基或丁基瓊脂糖凝膠 FF 疏水色譜分離，如果是有糖基結構或者受體等，也可以用親和色譜的方法。
6. 純化抗體和抗原
蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 可以用于分離純化各種來源的抗體，包括抗血清、培養液以及腹水等樣品。蛋白 A 可以特異吸附 IgG 的 Fc 區，所以它也適合分離酶解后的Fc 片段，把 Fab 片段和 Fc 段分離。同時蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 也可用于血清中IgG 的分離，得到不含抗體的血清，蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 有很好的穩定性，能耐受 37 度 3-5 天而對柱子的性能沒有影響，是分離抗體的最佳選擇。
疏水色譜色譜填料苯基瓊脂糖凝膠 FF 以及 DEAE 瓊脂糖凝膠 FF 也場用于抗體的分離，只是特異性不如重組蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 好。
純化 IgG 抗原最有效的辦法是免疫親和，具體的方法是把抗抗原的 IgG 直接偶聯到環氧活化瓊脂糖凝膠 FF 上，然后直接高 pH 吸附，低 pH 洗脫就可以得到需要的抗原。
對于高親和力的抗體篩選，特別是小分子的半抗原，我們建議可以把半抗原偶聯到環氧活化瓊脂糖凝膠 FF ，把只和抗原結合的 IgG 分離，得到高親和力的抗體，非常方便和實用，此外也可以選擇氨基化瓊脂糖凝膠 FF 或羧基化化瓊脂糖凝膠 FF偶聯半抗原，特別是對那些不適合用環氧活化瓊脂糖凝膠 FF 偶聯的半抗原。如果要偶聯的是小分子的物質，需要用 11 個碳原子親和手臂的活化好的填料，這樣才能克服空間位阻得到最佳分離效果，如果是大分子的物質，那最好用 3 個碳原子親和手臂的活化好填料就可以，這樣栽量高，效果好。
IgM 和 IgY 可用吡啶瓊脂糖凝膠 FF 親和的方法把它們和雜蛋白分離。
7. 純化重組蛋白
重組蛋白構建已經考慮到純化的問題，大大簡化了純化的步驟，但還是會遇到些實際的問題，所以需要詳細閱讀使用說明和注意事項。
( 一 )HIS 標簽重組蛋白可以很方便用鎳瓊脂糖凝膠 FF 分離，色譜填料已經螯合好了鎳離子，使用非常方便，吸附載量更高，特異性更強，可以選擇多種洗脫方式，是純化這類融合蛋白的最佳工具。
( 二 )ST 融合蛋白在表達時同時表達了谷胱甘肽 s 轉酶，很方便用 GST 瓊脂糖凝膠 FF 分離，然后再用腸激酶或凝血酶等酶解就得到表達的產物。而凝血酶可以用肝素瓊脂糖凝膠 FF 或苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF 分離。
( 三 ) 蛋白 A 融合蛋白可以用 IgG 瓊脂糖凝膠 FF 分離。
( 四 ) 涵體蛋白的色譜復性 : 離子交換和疏水色譜都在包涵體復性中有很好的效果，金屬螯合色譜填料等親和色譜填料也常用于帶 HIS 標簽融合蛋白的色譜復性。